2003 年第23卷有機(jī)化學(xué)Vol. 23. 2003第11期，1320- 1323Chinese Jounal of Organice ChernisiryNo. 11. 1320- 13.學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài).多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法王良友” 劉克良(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所北京100850)摘要聚乙二醇是一類具有獨(dú)特理化性 質(zhì)的大分子聚合物多肽和蛋白質(zhì)類藥物經(jīng)聚乙二醇共價(jià)修飾后能明顯改善其藥代學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，,如降低免疫原性、增加對(duì)蛋白水解酶的穩(wěn)定性.增加水溶性及延長(zhǎng)體內(nèi)的半衰期等.蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究已取得較好的效果.多肽的聚乙二醇化修飾研究起步較晚.對(duì)近年來多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法進(jìn)行了綜述.主要介紹了對(duì)多肽和蛋白質(zhì)的N端.C端及某些氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行選擇性聚乙二醇化修飾的方法.關(guān)鍵詞聚乙二醇, 聚乙二醇化修飾,多肽,蛋白質(zhì)Methods of Peptide and Protein PegylationWANG, Liang You"LIU, Ke-Liang( lstiute of Phamacologo and Toriology, Academy of Miliany Melical Scienes ，Beying 100850)Abstract With typical molecular weights of 500 ~ 20000, polyethylene glycol (PEC) is nontoxic, nonimmunogenicand soluble in aqueous solutions as well as in most organic solvents. The covalent atchment of PEC ( pegylation) topeptides and proteins can significantly improve their pharmacological and biological properties, such as shieldingimmunogenic epitopes, preventing degradation by proteolytic enzymes, increasing solubilty, reducing renal fltrationand altering biodistribution. Some methods in this field especially on site-directed pegylation for amino, carboxyl andthiol groups of peptides and proteins are reviewed.Keywords polyethylene glycol, pegylation, peptide, protein聚乙二醇(palyethylene glycol, PEG)是一類具有獨(dú)特理化步的研究表明.蛋白質(zhì)經(jīng)聚乙二醇化修飾后還可以改善許多性質(zhì)的大分子聚合物.它具有良好的水溶性,也能溶于二氯其它方面的性質(zhì),如增加蛋白質(zhì)對(duì)酶的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)蛋白質(zhì)甲烷、N":N"-二甲基甲酰胺、苯、乙腈和乙醇等有機(jī)溶劑.聚乙在血漿中的半衰期、增加在水中的溶解度等|1-~3l.-.些蛋白二醇由環(huán)氧乙烷聚合而成,通過控制反應(yīng)條件可得到平均分質(zhì)的聚乙二醇化修飾物在作為藥物的應(yīng)用中取得了較好的子量由幾百到幾萬的聚合物.普通的聚乙二醇分子兩端各有效果.1991年,第一種經(jīng)聚乙二醇化修飾的蛋白質(zhì)類藥物一個(gè)羥基,若一端以甲基封閉則得到單甲氧基聚乙二醇PEG腺苷脫氨酶被FDA批準(zhǔn).上市'4 ,用于治療- .種嚴(yán)重的(mononethoyolyethylene eyco, mPEG). 在多肽和蛋白質(zhì)的兒童免疫缺陷癥. 2001年,用聚乙二醇修飾的干擾素(PEC-聚乙二醇化修飾(eglain)研究中應(yīng)用最多的是mPEG的INTRON)經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市15.),用于治療慢性丙型肝炎.多衍生物.肽與蛋白質(zhì)在理化性質(zhì)上具有許多相似之處.肽類化合物的聚乙二醇化修飾研究晚于蛋白質(zhì)的相關(guān)研究,近年來關(guān)于肽PEG: HO -(CH2CH20)n- -CH2CH2-0H類化合物的聚乙二醇化修飾研究也取得了一些進(jìn)展.尤其是mPEG: CH2O -(CH2CH20)。- - CH2CH2- -OH肽類化合物在聚乙二醇化定點(diǎn)修飾方面較蛋白類物質(zhì)更易于實(shí)現(xiàn)，因此開展肽類化合物的聚乙二醇化修飾研究也具有蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究始于二十世紀(jì)七十年代，較重要的意義.最初的目的主要是為了降低蛋白質(zhì)類藥物的免疫原性.進(jìn)-一在多肽的聚乙二醇化修飾研究中應(yīng)用最普遍的是中國(guó)煤化工E-mail: liangwang@ 163. net; Te!: 01066932302; Fax: 010-68211656.Received Febnuary 26. 2003; resed June 1l, 200; acopted August 7, 200.MHCNMHGNo.11王良友等:多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法1321mPEC,先在mPEG的末端引人羧基、氨基或其它活性基團(tuán)，或者制備經(jīng)mPEC修飾的氨基酸衍生物，再利用固相或液NK相法將其偶聯(lián)到肽序列中去.實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽的N端,C端及某些氨基酸側(cè)鏈的聚乙二醇化修飾.下面主要介紹近年來文獻(xiàn)mPEG-0H + Ts-ClEgN. mPEG-OTs .報(bào)道關(guān)于多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化定點(diǎn)修飾的- -些方法.1多肽和蛋 白質(zhì)中氨基的聚乙二醇化修飾方法H2N-NH:H2OmPEG- -NmPEG-NH2在多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法中，主要是對(duì)NmPEG-NHCOCH2CH2COOH末端或賴氨酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行酰化修飾因?yàn)榈鞍捉Y(jié)構(gòu)中通常存在多個(gè)氨基,所以控制和確定修飾位點(diǎn)及修飾程度-直是Scheme 1蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中的一個(gè)難點(diǎn).肽類化臺(tái)物的合成中可以通過采用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)策略來實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基的定點(diǎn)修飾.Lee等[9]以平均分子量為5000 的單甲氧基聚乙二醇甲1.1 N端氨基的酰化修飾酰琥珀酰亞胺(SC-mPEG)在弱堿性水溶液中(pH= 8)修飾鮭為了實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈中氨基的聚乙二醇化?；揎?需要在降鈣素(sCT),經(jīng)RP-HPLC分離得到N端1y"和Iys"側(cè)鏈聚乙二醇上首先引入羧基或活化的羰基.1993年,Lu等[1]首氨基分別被聚乙二醇?；揎椀娜N產(chǎn)物,產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)酶解先報(bào)道了在固相多肽合成中應(yīng)用單甲氧基聚乙二醇的羧基和質(zhì)譜分析得到確證,它們?cè)诖笫竽I臟勻漿中的半衰期分別術(shù)生物對(duì)肽鏈的N端氨基進(jìn)行酰化修飾的方法:以mPEG作為125.5, 157.3和281.s min,比sCT在大鼠腎臟勻漿中的半原料,先合成mPEG- -OCH2CO0H 和mPEC-0CH2CO- -Nle-衰期(4.8 min)顯著增加.用相同的方法,Lee等[10以平均分OH,在mPEG中引入一個(gè)正亮氨酸(Nle)作為標(biāo)記是為了便子量為3400的SC-mPEC對(duì)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)進(jìn)行修飾，于確定每一-個(gè)多肽分子上偶聯(lián)了幾個(gè)mPEC分子.應(yīng)用Fmoc經(jīng)RP-HPLC分離到N端、Ly38和Lys8S側(cè)鏈氨基分別被聚乙固相多肽合成法,先在樹脂上合成全保護(hù)肽鏈，當(dāng)游離出N二醇酰化修飾的三種產(chǎn)物.生物活性測(cè)定表明,N端修飾產(chǎn)末端氨基后,以BOP作縮合劑,將mPEG--0CH.CO- -Nle-物活性高于Ly?"和Lys側(cè)鏈修飾產(chǎn)物.OH作為一個(gè)單體偶聯(lián)到肽鏈上,然后經(jīng)三氟乙酸裂解和反SC-mnPEG及其類似物在蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中應(yīng)相高效液相色譜(RP.HPLC)純化得到了平均分子量分別為用較多,反應(yīng)條件容易實(shí)現(xiàn),一般在弱堿性的水溶液中進(jìn)行.2000和5000的mPEG修飾N.端的4肽.8肽和12肽,mPEG控制蛋白質(zhì)和SC-mPEG的比例可以得到單聚乙二醇化修飾修飾產(chǎn)物在RP-HPLC分析圖譜上呈單一峰,結(jié)構(gòu)經(jīng)MALDT-的產(chǎn)物產(chǎn)物的純化方法也比較簡(jiǎn)便,可用透析電泳及凝膠TOF-MS分析得到確證研究還表明，聚乙二醇對(duì)三氟乙酸處色譜等常用方法實(shí)現(xiàn).由于SC-mPEC對(duì)游離氨基沒有選擇理穩(wěn)定,但氟化氫處理時(shí)會(huì)有部分?jǐn)嗔?故此法不適用于性,當(dāng)有多個(gè)氨基時(shí),往往難以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的聚乙二醇化修飾，Boc固相多肽合成法(Eq.1).分析和確定產(chǎn)物中聚乙二醇的修飾位點(diǎn)也較難(Eq. 2).mPEG-OH + BrCH2C0OCH2CH3BuLiSC-mPEG: mPEG- -0-mPEG-0OCH2C0OCH2CH3(1) NaOH_- mPEG- -OCH2C0OH (1)(2)HCT0雖然mPEC- -OH 與琥珀酸酐反應(yīng)可以很容易地得到mPEG-- -0COCH2CH2C00H,但此分子中含有對(duì)酸和堿都不太mPEG-0-+ H2N-PeptidepH=g.穩(wěn)定的酯鍵,,不適合用于固相多肽合成中.若通過mPEG-NH2與琥珀酸酐反應(yīng)引人羧基得到mPEG- -NHCO-CH2CH2COOH,此類分子具有較好的穩(wěn)定性,適用于固相多mPEG-0-C-HN-Peptide(2)肽合成中.mPEC--NH2可通過購(gòu)買商品化試劑獲得,也可以由mPEG- - OH作原料合成[8].在mPEC- -0CH2COOH 的合成1.2 賴氨酸鍘鏈氨基的酰化修飾中應(yīng)用了丁基鋰,反應(yīng)需在絕對(duì)無水條件下進(jìn)行,而Lu等*川]報(bào)道以mPEC羧基衍生物修飾賴氨酸側(cè)鏈氨基mPEG- -NHC0CH2CH2C0OH的合成比較容易些(Scheme 1).中國(guó)煤化工MYHCNMHG1322有機(jī)化學(xué)Val. 23. 2003得到Fmoc-Lys( mPFG- -0CH2CO)- -OH, 在固相多肽合成中將mPEG- -NH2 + Fmoc-Asp- -Bu-BOP其作為一個(gè)單體偶聯(lián)到肽鏈中去，實(shí)現(xiàn)聚乙. _醇對(duì)肽鏈中特定賴氨酸側(cè)鏈氨基的聚4二醇化修飾.也可以在固相合成過mosaP(mPFG- -NH)-OBu+ TFA。中用烯丙氧羰基(Aloc)保護(hù)特定位置的賴氨酸側(cè)鏈氨基.肽FmoC-Asp(mPEG- -NH)-OH鏈組裝完畢后先脫除Alloe,再將mPEG- 0CH2C00H 偶聯(lián)到Scheme 3賴氨酸側(cè)鏈氨基上去.然后經(jīng)三氟乙酸裂解、RP-HPIC純化可得到對(duì)肽鏈中特定賴氨酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行聚4二醇化修飾3多肽和蛋白質(zhì)中巰基的聚乙二醇化修飾方法的產(chǎn)物.此法適用于Fmxe固相多肽合成法中對(duì)賴氨酸的定點(diǎn)聚乙二醇化修飾(Scheme 2).Campbell等[3]在生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)類似物的C端引人半胱氨酸,在mPEG上引人巰基吡啶,然后通過.二硫鍵交換實(shí)現(xiàn)mPEG對(duì)CRF類似物C端的修飾(Eq.4).HOSu: HO-NPepide- -SI+ mPEG-S-p=4mPEG-OCH2COOH .HOSu/ DCCmPFG-OCH2COOSuPeptide--S-S- mPEG(4Fmoc-Lys- -OHFmoc-Lys (mPEG-0CH2CO)- -0HVanetswinkel 等141用定點(diǎn)突變法在蛋白質(zhì)中引人半胱氨酸,以mPEG MAL作為聚乙二醇化試劑，通過蛋白質(zhì)上的Scheme 2巰基加成到mPEC-MAL的雙鍵上實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾，此法已在許多蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中取得了良好的效1.3 N端氨基的烷基化修飾.果15.161 .mPEC-MAL可通過商品化試劑買到,也可以用Kinstler等12用聚乙二醇的醛基衍生物(mPEG--CH0)mPEC- -NH2為原料合成[17].若在肽鏈中引入半胱氨酸,也可修飾rhG-CSF.反應(yīng)在pH為5.0的水溶液中進(jìn)行.活潑的醛以實(shí)現(xiàn)此類反應(yīng)(Schene 4).基可將聚乙二醇偶聯(lián)到蛋白質(zhì)分子的氨基上,同時(shí)以氰基硼氫化鈉作為還原劑實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的烷基化修飾.此法具有較好的選擇性,主要是修飾蛋白質(zhì)的N末端氨基.其溫和的反應(yīng)條mPEG-MAL: CH20- (CH2CH20)= -CH2CH2 -N件適用于固相或液相多肽合成.此法若應(yīng)用于多肽的N端.氨基修飾可能也會(huì)取得較好的效果(Eq.3).NaCNBH3ymPEG-C-H+ H2N-Protein(1) Maleic anhydridemPEG- -NH2(2)ACQONaOH mP:C-YmPEG- CH2- -HN- -Procin3)02多 肽鏈中羧基的聚乙二醇化修飾方法pH= 7-8mPEG-B + HS-PepideLu等!川以mPEC--NH2作原料修飾天冬氨酸側(cè)鏈羧基得到Fmoc- Asp(mPEC- NH)一 OH,將其用到固相多肽合成中-S-Pepide實(shí)現(xiàn)聚乙二醇對(duì)肽鏈中天冬氨酸側(cè)鏈羧基的修飾.也可以在mPEG一1合成過程中用烯丙基(Al]yl)保護(hù)特定位置的天冬氨酸側(cè)鏈羧基,肽鏈組裝完畢后在固相上先脫除Allyl,再將mPEC-NH2偶聯(lián)到天冬氨酸側(cè)鏈羧基上,實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈中特定天冬氨Scheme 4酸側(cè)鏈發(fā)基的聚乙二醇修飾.此法適用于Fmoe固相多肽合成法中對(duì)天冬氨酸或谷氨酸的定點(diǎn)聚乙二醇化修飾(Scheme4其它方法在固相多肽合成中,若先將Fmoc-NH- -PEG -C00H偶近年來,蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法發(fā)展很快,為多.聯(lián)到樹脂上，再合成肽鏈.最后用三氟乙酸裂解,可以實(shí)現(xiàn)肽肽的聚中國(guó)煤化工年。Wylie等8通過控鏈C末端羧基的聚乙二醇化修飾.制pH值CNMHG1質(zhì)中的組氨酸側(cè)鏈No.11王良友等:多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法1323的瞇唑基. Satd191 用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶( transglutaminase,Ishi. A.; Ueno, T. Prog. Polbm. Si. 1998, 23. 1233.TCGase)將mPFG-NH2轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的谷氨酰胺側(cè)鏈上,實(shí)現(xiàn)Inada, Y.; Funukawa, M.; Sasaki, H.; Kodera. Y; Iliroto ,M; Nishimua, H.; Matsushina, A. Trends Bioterhnol. 1995,對(duì)谷氨酰胺的選擇性修飾.借鑒這些方法.也有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈中組氨酸和谷氨酰胺側(cè)鏈的選擇性聚乙二醇化修飾13, 86.Kozloski, A.; Harris. J. M. J. Cortrouled Relese 2001. 72.(Eq. 5).217.6 Wang, Y. S.; Youngster, s; Crace, M; Bausch, J;mPFG-NH2 + R- -CONH2 Luas mPEG- -NHOC- -R (5) .Bordens, R.; Wyss, D. F. Adu. Drug Deliuery Rer. 2002, S4.547.lu, Y. A.; Felix, A. M. Pept. Res. 1993, 6. 140.5結(jié)束語8 Haris, J. M.; Struck, E. C.; (Case, M. C.: Paley. M. s. J.Poly. Sci.. Poly. Chem. Ed. 1984, 22, 341.隨著蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾技術(shù)的迅速發(fā)展,肽類化9 Lee, K. C.; Morm. s. C.; Park, M.0.; Lee, J T: Na.合物的聚乙二醇化修飾研究越來越引人注目20).蛋白質(zhì)的D. H.; Yoo, s. D.; lee, H. s.; DelLucd, P. P. Pharm.聚乙二醇化修飾幾乎都在水溶液中進(jìn)行,通過選擇合適的聚Res. 99，16, 813.乙二醇化試劑或控制反應(yīng)條件來實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)、定量修飾.肽類10 Lee, H; Park, T. G. Pharm. Res. 2002, 19, 845.化合物的聚乙二醇化修飾可在固相載體上進(jìn)行,此法易于實(shí)11 Lu.Y. A.; Feix, A. M. Imt. J. Pept. Prolein Res. 194.現(xiàn)對(duì)多肽鏈中某位點(diǎn)的選擇性修飾,但固相合成反應(yīng)速度43.127.慢,且隨著聚乙二醇或多肽分子最增加，修飾難度增大;肽類12 Kinsler, 0. B.; Brems, D. N,; lauren, s. T; Paige, A. (.:Hamburger, J. B.; Treubeit, M. J. Pham. Res. 1996， I3,化合物的聚乙二醇化修飾也可以在水溶液中進(jìn)行,可以實(shí)現(xiàn)分子量較大的聚乙二醇對(duì)分子量較大的多肽的修飾,但若有996.多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)時(shí)產(chǎn)物分離及修飾位點(diǎn)的確定都有較大的難I3 Campbell, R. M; Heimer, E. P.; Ahmad, M.: Eiseubeis. H.G.; Lambros. T. J; Lee, Y.; Miller, R. w; Stnicker. P.度.多肽和蛋白質(zhì)類化合物經(jīng)聚乙二醇化修飾后具有降低免R.; Felixs, A. M.1. Pept. Res. 1997. 49, 527.疫原性增加水溶性、顯薯延長(zhǎng)其在生物體內(nèi)的半衰期等優(yōu)14 Varwetsewinkel, S.; Plaisance, S.; Zhang， Z.; Valinthour,點(diǎn),但也可能因修飾而影響其與受體的結(jié)合,因此尋找合適1; Brepoels, K.; Lasters, 1; Collen, D.: Jespers, 1.. Blood的修飾位點(diǎn),保持持續(xù)、有效的生物活性是多肽和蛋白質(zhì)的2000, 95. 936.聚乙二醇化修飾研究的主要目的.多肽和蛋白質(zhì)類藥物的聚15 Goodson, R. J.; Katre, N. V. Bio/ Technologsy 1990. 8, 343.乙二醇化修飾研究有較好的應(yīng)用前景.16 He, X. H.; Shaw, P. C.; Tam, S. C. lifeSri. 1999, 65.355.References17 Kogan, T. Symth. Commun. 1992, 22 , 2417.18 Wylie, D. C.; Voloch, M.; Lee, S.; liu, Y. H; Cannon-Zalipsky, s. Adu. Drug Delivery Rer.1995, 16, l57.Carlson, S.; Cutler, C.; Pramanik. B. Pharm. Res. 2001,? Roberts, M. J.; Bentley, M. D.; Haris, J. M. Adur. Dnug .I8, 1354.Delinery Rev. 2002, 54, 459.19 Salo, H. Adu. Drug Delinery Rev, 2002, 54, 487.3 Kodera, Y.; Matsushima, A.; Hiroto, M. ; Nishimura. H;20 Veronese, F. M. Biomaterials 2001, 22, 405.(Y0302262 QIN. x. Q.; UING, J.)中國(guó)煤化工MYHCNMHG