第10卷第3期程工程學(xué)報VoL 10 No. 32010年6月The Chinese Journal of Process EngineeringJune 2010胰高血糖素樣肽-1在乙醇中的聚乙二醇修飾王友傲1,翟艷琴,雷建都',馬光輝',蘇志國(1.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100190;2.中國科學(xué)院研究生院,北京10009摘要:以乙醇為溶劑,單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯( mPEG-SC)為修飾劑,對胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)進(jìn)行了修飾反應(yīng)條件的優(yōu)化,同時對單修飾產(chǎn)物 Mono-PEG-GLP-1進(jìn)行分離純化,并考察了其體外穩(wěn)定性和體內(nèi)活性.得到的優(yōu)化反應(yīng)條件為:GLP1濃度1mgmL, mPEG-SC與GLPl摩爾比1:1,37℃下反應(yīng)24h,該產(chǎn)物最高轉(zhuǎn)化率達(dá)77%采用冷凍離心方式對 Mono-PEG-GLP1進(jìn)行初步分離和濃縮,然后經(jīng)反相液相色譜進(jìn)一步高效純化,純度可達(dá)97%以上。體外實(shí)驗(yàn)表明, Mono-PEG-GLP-1在血清中具有更好的穩(wěn)定性及更強(qiáng)的抗胰蛋白酶消化能力.體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)表明, Mono.PEG-GLP1具有更好的降血糖作用關(guān)鍵詞:胰高血糖素樣肽-1:單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯;聚乙二醇修飾;乙醇中圖分類號:Q5143;R915文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1009606X(2010)03-0593-051前言率需加入過量修飾劑(修飾劑與GLP-1摩爾比達(dá)21甚至5:1以上)。,易導(dǎo)致 Mono-PEG-GLP.1繼續(xù)與胰高血糖素樣肽1( Glucagon-like Peptide-1,GLPl) mPEG-SC反應(yīng)生成多修飾產(chǎn)物連接2個或2個以上聚是體內(nèi)L細(xì)胞分泌的葡萄糖依賴性腸降血糖多肽激素,乙二醇鏈的修飾產(chǎn)物),造成修飾反應(yīng)所得具有阻止胰腺細(xì)胞退化、刺激細(xì)胞的增殖和分化、促進(jìn) Mono-PEG-GLP-l的轉(zhuǎn)化率較低,最多僅為50%明胰島素生成等作用.在2型糖尿病( Type2 Diabetes另一方面,由于修飾產(chǎn)物組分很復(fù)雜,含未修飾的Mellitus,T2DM治療方面有良好的應(yīng)用前景,成為近年GLP1、多修飾GLP-1、單修飾GLP1及未反應(yīng)的修飾來糖尿病治療藥物的研究熱點(diǎn).但GLP1易被體內(nèi)二肽劑等組分,雖然可用反相液相色譜分離,但修飾反應(yīng)液基肽酶Ⅳ等酶降解,易被循環(huán)系統(tǒng)清除,半衰期很短是乙醇溶液,導(dǎo)致 Mono-PEG-GLP-l在色譜柱上不易吸(2min左右).另外,因具有免疫原性和抗原性,大大限附,因此不能直接將反應(yīng)液上樣,在采用反相液相色譜制了其臨床應(yīng)用1進(jìn)行分離前需將反應(yīng)液用超純水稀釋5倍,導(dǎo)致多次蛋白質(zhì)或多肽類藥物的聚乙二醇[ Poly(ethylene樣分離,增加了分離純化的成本和時間,不利于放大制glycol),PEG修飾技術(shù)是一種通過化學(xué)反應(yīng)將蛋白質(zhì)或備多肽分子與聚乙二醇大分子共價連接的技術(shù),其突出優(yōu)本研究以乙醇為反應(yīng)溶劑,采用分子量5kDa的單勢在于能降低藥物的免疫原性和抗原性,減少循環(huán)系統(tǒng)甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯( mPEG-SC修飾劑清除速率,從而有效延長藥物體內(nèi)循環(huán)半衰期現(xiàn)已有對GLP1進(jìn)行修飾,考察了修飾反應(yīng)條件對10種長效聚乙二醇藥物經(jīng)美國食品及藥物管理局批準(zhǔn) Mono-PEG-GLP.1轉(zhuǎn)化率的影響分離純化過程中采用上市,取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益6低溫冷凍離心方法對修飾反應(yīng)液進(jìn)行預(yù)處理,在去除未目前主要采用修飾劑單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞修飾GLPl的同時獲得高濃度的 Mono-PEG-GLP1,進(jìn)胺丙酸酯[ Monomethoxy Poly(ethylene glycol而結(jié)合反相液相色諾獲得純度高達(dá)9%的單修飾產(chǎn)物succinimidyl propionic acid esther),mPEG-SPA門、單甲最后,考察了 Mono-PEG-GLP-在血清中的穩(wěn)定性、抗氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯[ Monomethoxy胰酶酶解能力及降糖效果Poly(ethylene glycol succinimidyl carbonate ), mPEG-SC)S)進(jìn)行GLP1的修飾研究但還存在一些問題,如二者很2實(shí)驗(yàn)易水解,在pH80、溫度25℃條件下,其半衰期分別2.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器僅有165和204min9為提高M(jìn)ono- PEG-GLP1轉(zhuǎn)化D1由化京中科亞光有限公中國煤化工收稿日期:201003-29,修回日期:201005-14基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目編號:20976179):國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(8VUCNMHG200043北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目編號:2092027)作者簡介:王友傲(1986-)男安徽省舒城縣人,碩士研究生,生物化工專業(yè):雷建都,通訊聯(lián)系人,Te:01082623602,Emai:jdei@ home. pe, ac cn.過程工程學(xué)報第10卷司提供,分子量5kDa的mPEG-SC由本實(shí)驗(yàn)室利用進(jìn)樣量100μ.通過軟件計算GLP-1及mPEG活化而得,mPEG( Polydispersity mPEG<1.08)Mono- PEG-GLP-1在色譜圖上對應(yīng)峰面積與初始峰面積購自美國 Union-Carbide公司,乙腈( Acetonitrile,ACN)、的比值,研究二者在大鼠血清中的保留行為三氟乙酸為色譜純,購自北京 Dikma公司;乙醇、甘氨動物體內(nèi)活性檢測:將體重300-340g的SD大酸為化學(xué)純,購自北京化學(xué)試劑公司.實(shí)驗(yàn)用水為鼠隨機(jī)分成3組,每組5只.實(shí)驗(yàn)前只給飲水,禁食過Millipore超純水機(jī)制備的電阻率182M2cm的超純水.夜.A組為空白對照,B組為GLP1對照,C組為實(shí)驗(yàn)用大鼠血清、SD大鼠均購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)Mono-PEG-GLP-1實(shí)驗(yàn)組.3組均腹腔注射葡萄糖18動物中心mmol/kg,A組腹腔注射生理鹽水作為對照,B組腹腔注LC20AT高效液相色譜儀(日本 Shimadzu公司),射18 nmolkg GLP1,C組腹腔注射18 molko高速離心機(jī)(美國 Sigma公司)Mono-PEG-GLP-1.在0,5,60,150min時眼底取血,用2.2實(shí)驗(yàn)方法血糖儀測定血糖濃度四Ps溶鐘于乙,y反一是間,加入3結(jié)果與討論過量甘氨酸終止反應(yīng)3.1反應(yīng)條件對單修飾產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響Mono- PEG-GLP.1的分離純化采用島津CBM20A聚乙二醇修飾中反應(yīng)條件的控制是影響目標(biāo)產(chǎn)物型液相色譜系統(tǒng),色譜柱為C18反相色譜柱(250mmx含量的重要因素.目前關(guān)于有機(jī)相如乙醇中的聚乙二醇4.6mmLD),洗脫液A為超純水+0.1%三氟乙酸,洗脫修飾研究報道較少,而GLP-1在乙醇中的修飾則未見報液B為乙腈+0.1%三氟乙酸.反相液相色譜洗脫方法:道.為此,實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了 mPEG-SC與GLP-1摩爾比、0-5min35%B,5-25min3%55B,25~30min35%B,GLP-l濃度和溫度對 Mono-PEG-GLP-1轉(zhuǎn)化率的影響B(tài)液的梯度變化由色譜系統(tǒng)按程序直接完成.流速13.1.1 mPEG-SC與GLP-1摩爾比對 Mono-PEG-GLP-lmL/min,檢測波長280mm,進(jìn)樣量100μ.通過軟件轉(zhuǎn)化率的影響計算Mono- PEG-GLP-1峰面積占各組分吸收峰面積之圖1是 mPEG-SC與GLP1摩爾比對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的和的百分比得 Mono-PEG-GLP1轉(zhuǎn)化率影響,表明 mPEG-SC與GLP-1摩爾比較低時,采用島津CBM20A型高效凝膠液相色譜系統(tǒng)檢測Mono- PEG-GLP-轉(zhuǎn)化率隨摩爾比增大而升高;達(dá)到Mono- PEG-GLP-1純度,色譜柱為 SuperdexTM75,流定水平后,隨摩爾比增大, Mono-PEG-GLP1轉(zhuǎn)化率呈動相為50mmoL磷酸緩沖液+100mmoL硫酸鈉+0.5%逐漸下降趨勢.這是由于mPEG-SC與GLP-摩爾比越疊氮化鈉,pH68,流速0.5 mL/min,檢測波長280m.大,多修飾產(chǎn)物越易生成,從而降低了 Mono-PEG-GLP1胰蛋白酶消化:按等摩爾比將一定濃度的GLP1轉(zhuǎn)化率.因此選擇 mPEG-SC與GLPl摩爾比為1進(jìn)行和Mono-PEG-GLP-1溶于20 mmolL的磷酸緩沖液中修飾研究文獻(xiàn)[8]在水溶液中采用 mPEG-SC進(jìn)行的(pH7.0),根據(jù)一定摩爾比加入胰蛋白酶,37℃孵育,GLP1修飾, mPEG-SC與GLPl摩爾比需達(dá)21甚至分別在0,15,30,60,120min取樣,置于4℃冰箱中終止更高,其 Mono-PEG-GLP1轉(zhuǎn)化率僅為50%反應(yīng).用反相液相色譜檢測反應(yīng)物的殘留量與加入量之比,考察胰蛋白酶對反應(yīng)物的消化降解作用GLPl及 Mono-PEG-GLP-1的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):將1mL大鼠血清加入20mL20mmoL的磷酸緩沖液(pH7)中,配成血清緩沖液,純化后的GLP1及Mono-PEG-GLP1按02mmoL溶于血清緩沖液,37℃孵育.定時取樣,離心取上清液,用反相液相色譜進(jìn)oou826m3B液的系數(shù)幫0個行分析檢測,色譜柱為C18反相色譜柱(250mm×46mmID),洗脫液A為超純水+0.1%三氟乙酸,洗脫液B為乙腈+0.1%三氟乙酸.反相液相色譜洗脫方法:0-5中國煤化工。cLP1min35%B,5~20min35%50%,20~25min100%BCNMHG-GLP轉(zhuǎn)化率的影響Fig 1oI rEu to uLr-l on the yield of接完成.流速1 mL/min,柱溫35℃,檢測波長280mm,Mono-PEG-GLP-第3期王友傲等:胰高血糖素樣肽1在乙醇中的聚乙二醇修飾312GLP1濃度對 Mono-PEG-GLP1轉(zhuǎn)化率的影響32冷凍離心結(jié)合反相液相色譜對 Mono-PEG-GLP-1的在聚乙二醇修飾過程中,肽濃度對單修飾產(chǎn)物轉(zhuǎn)化分離純化率有重要影響,GLP-1濃度對 Mono-PEG-GLP1轉(zhuǎn)化修飾反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)液中除 Mono-PEG-GLP-1率的影響見圖2.結(jié)果表明低濃度時 Mono-PEG-GLP1外仍存在少量未修飾的GLP1、多修飾產(chǎn)物及未反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率隨GLP1濃度增大而增大,到一定水平后, mPEG-SC.為此,對少量經(jīng)甘氨酸終止反應(yīng)的修飾反應(yīng)Mono-PEG-GLP1轉(zhuǎn)化率隨GLP1濃度增大而逐漸減小.液用水稀釋后采用高效反相液相色譜法進(jìn)行分離,計算這是由于在高濃度下反應(yīng)溶液中生成的多修飾產(chǎn)物多.Mono- PEG-GLP1轉(zhuǎn)化率.在C18色譜柱上GLP-1保留因此GLP-1濃度取1mg/mL時間為152min, Mono-PEG-GLP1保留時間為193313溫度與反應(yīng)時間對 Mono-PEG-GLP.1轉(zhuǎn)化率的影響min,二者分離度大于2,分離效果好,結(jié)果見圖4(a)在 mPEG-SC與GLP摩爾比為1和GLP1濃度1和圖4b).但在制備 Mono-PEG-GLP1時,由于修飾反mg/mL的條件下,考察了溫度對 Mono-PEG-GLP1轉(zhuǎn)應(yīng)液為乙醇,若直接上樣 Mono-PEG-GLP-1,不易在反化率的影響,結(jié)果見圖3.溫度升高提高了修飾反應(yīng)的相液相色譜的色譜柱上吸附.為此,需將反應(yīng)液用超純速度,Mono- PEG-GLP1轉(zhuǎn)化率提高;但溫度進(jìn)一步升水稀釋5倍后才能上樣分離,這就需多次上樣分離,增高,GLP1中的手性氨基酸的旋光性易發(fā)生變化而導(dǎo)致大了分離純化成本和時間,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),活性降低4.因此選擇37℃作為修飾反應(yīng)的溫度.修 Mono-PEG-GLP1、多修飾產(chǎn)物在乙醇中的溶解度隨溫飾反應(yīng)進(jìn)行24h后, Mono-PEG-GLP1轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大度降低而下降,因此采用低溫冷凍離心方式初步分離值.因此選擇溫度37℃,反應(yīng)時間24h.Mono-PEG-GLP1,將反應(yīng)液在4℃條件下高速(10000dTemperature(℃)2AkL0.8GLP-1 concentration(mg/mL)圖2GLP1濃度對 Mono-PEG-GLP.1轉(zhuǎn)化率的影響圖3溫度對Mono- PEG-GLP1轉(zhuǎn)化率的影響Fig 2 Effect of GLP-1 concentration on the yield ofFig 3 Effect of temperature on the yield ofMono-PEG-GLP-]Mono-PEG-GLP(b)Reaction mixture200. (e)SedimentEGLP-1Mono-PEG-GLPGLP-10中國煤化工m圖4GLPl、反應(yīng)混合物和低溫離心Fig 4 Reverse phase high performance liquidCNMHGreaction mixture and sediment of reaction mixture under frozen condition過程工程學(xué)報第10卷r/min)離心15min后,將上清液、沉淀分別進(jìn)行檢測,在大鼠血清中的穩(wěn)定性及抗胰蛋白酶降解作用.結(jié)果見表1,表明冷凍離心有效去除了大量未修飾331GLP-1及 Mono-PEG-GLP1在大鼠血清的穩(wěn)定性GLP-1,實(shí)現(xiàn)了修飾產(chǎn)物的預(yù)分離.將離心所得沉淀用GLP1與 Mono-PEG-GLP1在大鼠血清中的穩(wěn)定性水溶解后,采用反相液相色譜進(jìn)行純化,結(jié)果見圖4(c),見圖6,顯示GLP1在血清中很快被水解成無活性的收集 Mono-PEG-GLP.[收集區(qū)間為圖4c)中GLP1(936)NH2,而修飾后的 Mono-PEG-GLP1的1844-2036min]后用高效凝膠液相色譜檢測,結(jié)果見圖穩(wěn)定性顯著增強(qiáng),在血清中可長時間保持穩(wěn)定,孵育135,單修飾產(chǎn)物純度為97%,收率達(dá)95%以上h后仍保留90%,未發(fā)生明顯降解,表明表1 Modif ied-GLP-1和叫LP1在修飾反應(yīng)液Mono- PEG-GLP-1比GLP-1在血清中的穩(wěn)定性顯著提高離心沉淀和上清液中的含量33,2胰蛋白酶酶解穩(wěn)定性檢測Table 1 Modified-GLP-l and GLP-I contents in the reaction圖7是GLP1與 Mono-PEG-GLP.1胰蛋白酶酶解動力學(xué)曲線.結(jié)果顯示,酶解05h后,GLP-l在酶解反GLP-1(, a)應(yīng)液中僅有5%殘留,而 Mono-PEG-GLP-1仍有23.6%Modifed-GLP-1 (% a保留,這表明修飾后的GLP-1能顯著增強(qiáng)抗胰蛋白酶降解的能力Mono-PEG-GLP.00000要880GLP-110圖5單修飾產(chǎn)物的高效凝膠液相色譜檢測圖0005Fig 5 High performance gel filtration liquid chromatographyTime(h)of purified Mono-PEG-GLP-l by reverse phase high圖7胰蛋白酶酶解GLP1和Mono- PEG-GLP1動力學(xué)曲線performance liquid chromatographyFig7 Digestion kinetics of GLP-I and Mono-PEG-GLP-I in3.3體外穩(wěn)定性檢測GLP1無復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu),極易被酶解而失去活3.4體內(nèi)活性檢測性,在體內(nèi)的半衰期極短,僅2min.聚乙二醇修飾后,為了考察 Mono. PEG-GLP1與GLP1的體內(nèi)活性能否抑制蛋白酶降解就成了檢定聚乙二醇修飾是否有將15只大鼠隨機(jī)分成3組,按18mmol/kg劑量給大鼠效的主要方式因此對比了 Mono-PEG-GLP.1和CLP1腹腔注射葡萄糖溶液,并定時觀察老鼠的血糖變化,結(jié)果見表2.在給藥150min后, Mono-PEG-GLP-1的降血糖效果明顯優(yōu)于未修飾GLP-1,結(jié)果見圖8.由于GLP-1在體內(nèi)半衰期短,所以其促胰島素分泌作用時間短,而08000mPEG-SO修飾后所得Mono- PEG-GLP-1在體內(nèi)的半衰Mono-PEG-GLP.期大幅度延長,促胰島素分泌作用時間長,因而降血糖效果更好表2LP1和 Mono-PEG碰LP1的降血糖效果比較(血糖濃度mmol/D 1 and Ma. DEG-GLP-1 on plasma中國煤某ucose content mmo/L)CN MH 601salino3±L0008±1.46圖6GLP1和 Mono- PEG-GLP1在大鼠血清中穩(wěn)定性GLP-164904517.02±145I34±1078060.54Fig 6 Stability of GLP-I and Mono-PEG-GLP-I in rat plasma Mono-PEG-GLP-1 6.08#0.32 16.770.88 9.95*1.01 6.47#0.76第3期王友傲等:胰高血糖素樣肽1在乙醇中的聚乙二醇修飾[2] Nathan D M, Schreiber E, Fogel H. Insulinotropic Action ofGlucagon-like Peptide-1(7-37)in Diabetic and Nondiabetic Subjects[ Diabetes Care,,1992,15(6:270-276[3] Nauck M A, Wollschlager D, Wemer J. Effects of SubcutaneousGlucagon-like Peptide-1(GLP-1 [7-36 amideD in Patients with1546-155[4] Arulmozhia D K, Porthab B. GLP-1 Based Therapy for Type Diabetes[EurJ. Pharm. Sci,2006,28(12):96-108Crawford J. Pegfilgrastim Administered Once per Cycle ReducesIncidence of Chemotherapy-induced Neutropenia []. Drugs, 2002,62(S1):89-89Zhai Y Q, Zhao Y J, Lei J D, et al. Enhanced Circulation Half-life ofSite-specific PEGylated rhG-CSF: Optimization of PEG Molecular圖8腹腔注射藥150min后大鼠體內(nèi)的血糖濃度Weight ] J. Biotechnol., 2009, 142(3/4): 159-166.Fig 8 Blood glucose concentration of the rats after[7]Lee S, Youn Y S, Lee S H, et al. PEGylated Glucagon-like Peptide-1drug injection for 150 minDisplays Preserved Effects on Insulin Release in Isolated Pancreatic4結(jié)論Islets and Improved Biological Activity in Db/Db Mice []Diabetologia,2006,49(7):1608-161l[8]張磊,翟艷琴,雷建都,等.胰高血糖素樣肽1的聚乙二醇定點(diǎn)(1)以分子量5kDa的 mPEG-SC為修飾劑,在乙醇修飾[過程工程學(xué)報,200,9(6:6-1173溶液中進(jìn)行GLP-1聚乙二醇修飾,優(yōu)化反應(yīng)條件為:9 Roberts m, Bentley M I, HanisM. Chemistry for Peptide andGLP-1濃度1mgmL,mPEG- SC/GLP-1摩爾比1:1,37℃Protein PEGylation [J]. Adv. Drug Del. Rev, 2002, 54(4): 459-476[10] Zalipsky s, Barany G Facile Synthesis of a-Hydroxy-co-反應(yīng)24h該條件下 Mono-PEG-GLP1轉(zhuǎn)化率可達(dá)77%,carboxy methylpolyethylene Oxdide. ] Bioact. Compat. Polym,遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報道的水溶液中的轉(zhuǎn)化率,且 mPEG-SC1990.502):227-23與GLP1摩爾比僅需1:1,降低了 mPEG-SC用量[l遲玉石,黃文龍,張惠斌,等.胰高血糖素樣肽1類似物的合成(2)通過低溫冷凍離心方法對 Mono-PEG-GLP1進(jìn)及其生物學(xué)活性研究[有機(jī)化學(xué),2008,28(11:1925-1931[12] Zhou J, Cai Z H, Li L, et al. Preparation and PEGylation of行預(yù)分離和濃縮,大大減少了后續(xù)分離純化難度和工作 Exendin.4 Peptide Secreted from Yeast Pichia pastoris[Eur.量,結(jié)合反相液相色譜法實(shí)現(xiàn)了 Mono-PEG-GLP1高效Pharm Biopharm, 2009, 72(2):412-417.純化, Mono-PEG-GLP-1純度達(dá)97%,收率達(dá)95%以上,3] Wang Y S, Youngster S. Grace M, et al. Structural and BiologicalCharacterization of PEGylated Recombinant Interferon Alpha-2b and3 Mono-PEG-GLP-1在血清中的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于未Its Therapeutic Implications [] Adv. Drug Del. Rev., 2002, 54(4修飾GLP1,對胰蛋白酶有更好的抗酶解能力,比未修飾GLP-1具有更好的降血糖作用[14] Senderoff R l, Kontor K M, Kreilgaard L, et al. Consideration ofConformational Transitions and Racemization during Process參考文獻(xiàn)Development of Recombinant Glucagon-like Peptide-1 [] J[1] Kieffer T J, Habener J F. The Glucagon-like Peptide [ EndocrinePharmacol. Sci, 1998, 87(2): 183-189Reviews,199205):876-913Modification of Glucagon-like Peptide-1 in Ethanol with Polyethylene GlycolWANG You-ao2, ZHAI Yan-qin 2, LEI Jian-du, MA Guang-buil, SU Zhi-gucState Key Lab. Biochem. Eng, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China;2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)Abstract: Glucagon-like peptide-l(GLP-l)was modified with monomethoxy polye(ethylene glycol succinimidyl carbonate) by usingethanol as a reaction medium. The reaction conditions were investigated and optimized, and the separation procedures of productMono-PEG-GLP-l were developed. After that, the stability in vitro and activity in vivo of Mono-PEG-GLP-1 were investigated. Theoptimized reaction conditions were obtained as follows: concentration of GLP-1 1.0 mg/mL, molar ratio of PEG to GLP-1 1: l, andreaction time 24 h at 37C. Under the optimized conditions, the yield of MongMono-PEG-GLP-l wasseparated from reaction mixture by a preliminary centrifugation under froze中國煤化工 cation by reverse phasechromatography. The purity of Mono-PEG-GLP-l was higher than 97%,CNMHG chromatography TheMono-PEG-GLP-l showed better stability in plasma, decreased proteolysisKey words: glucagon-like peptide-1; monomethoxy poly(ethylene glycol succinimidyl carbonate); PEGylation; ethanol