第22卷第2期云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)VoL 22 No. 2Journal of Yunnan Normal UniversityMar. 2生物質(zhì)細(xì)菌制氫楊運(yùn)嘉,胡志華(云南師范大學(xué)能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,云南昆明650092)摘要:該文討論了用吸附技術(shù)將腸菌固定在木質(zhì)纖維材料如稻杄、甘蔗(甜菜)渣和椰纖維等固體基質(zhì)上,用發(fā)酵工藝生產(chǎn)氫氣的方法。文中著重介紹了如何通過(guò) TCA cycle(三羧酸循環(huán))使葡萄糖酵解產(chǎn)生大量的NADH(還原型二磷酸吡啶核苷酸),抑制NADH脫氫酶絡(luò)合物的電子遷移鏈而得到最高氫氣產(chǎn)量。通過(guò)氧或其它電子受體的電子遷移鏈重新氧化FADH2(還原型黃素腺嘌呤二核苷酸)。這種方法對(duì)于用氫化酶的兼性厭氧細(xì)菌或需氧細(xì)菌是有效的。關(guān)鍵詞:產(chǎn)氫;發(fā)酵;腸菌;三羧酸循環(huán);電子遷移鏈;抑制中圖分類號(hào):Q939-64.111文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1007-9793(2002)02-45-05隨著使用化石燃料(石油、煤、天然氣等)對(duì)環(huán)H2,式(3):境帶來(lái)的污染和資源的限制,氫,這種無(wú)污染能源(3)C6H12O6+2H2O已提到了21世紀(jì)的動(dòng)力這一高度。制氫的方法很4H,+2CH COOH-+2CO多,其中,用農(nóng)業(yè)廢料作支承基質(zhì),經(jīng)微生物發(fā)酵若使葡萄糖通過(guò)需氧菌致分解,卻能得到進(jìn)行細(xì)菌制氫,就環(huán)境、工藝、廢物利用和生態(tài)平10 moI NADh,即需氧的和兼性厭氧的細(xì)菌經(jīng)過(guò)衡來(lái)說(shuō)都是有很大吸引力的。尤其是城市中大量TCA循環(huán),除從糖酵解作用得到2 mol nadh排放的廢棄物多是發(fā)酵制氫的良好基質(zhì),這將為外,還生成8 moI nadh,見(4)、(5)式。就地垃圾處理和生產(chǎn)氫氣提供一種合理的方法。糖酵解但目前發(fā)酵制得的氫氣產(chǎn)量還小,如何提高產(chǎn)氬(4)C6H12O5+2NAD+(+2ADP)率就是這種方法待解決的迫切問(wèn)題。這篇論文擬2CH COCOOH-+2NADH-+2H(+2ATP)就如何提高氬氣產(chǎn)量推薦一種新的策略ADP:腺苷二磷酸,ATP:三磷酸腺苷)羧酸循環(huán):1釋放氫氣的NADH體系(5)2CH, COCOOH+ 8NAD*+ 2FAD+6H, O(+2ADP)許多細(xì)菌都能通過(guò)發(fā)酵的NADH途徑釋放6CO,+8NADH+8H++2FADH, (+2ATP)氫氣(FAD黃素腺嘌呤二核酸)由1mol葡萄糖的同化作用得到2 mol nad(4)+(5)=(6)H,式(1)(6)CH12O6+10NAD++2FAD+6H2O(+(1)C6H12O+2NAD4ADP)CH3 (CH,), COOH-+2CO,+2NADH-+2H+6CO,+ 10NADH+ 10H*+ 2FADH,(+(NAD:二磷酸吡啶核苷酸)aTP)經(jīng)由酵素(酶)反應(yīng)釋放2mo氫氣1,式(2):中國(guó)煤化工2 molFADH通過(guò)電子(2)2 NADH+2HT--2NAD*+2HCNMHG波重新氧化上面的丁酸酯發(fā)酵途徑可得到2molH22(7)NADH-+H++1/20,-NAD+H,O若經(jīng)改良的醋酸酯發(fā)酵途徑,可期望得到4mol(8)FADH,+1/202>FAD+H,O*收稿號(hào)數(shù)據(jù)1-08-31作者簡(jiǎn)介:楊運(yùn)嘉(1941—),男,云南省昆明市人,副教授,從事氬能研究4云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)△G。=-20 KJ mol,K′=1.1×105Citrate+CoA-H+H如果能利用所有這些FADH,而且,FADH也作為H釋放源,我們就可期望從lmol葡萄糖然而,這個(gè)反應(yīng)的ΔG′。負(fù)值很大(-32得到最高12mo氫產(chǎn)量2KJ.mol-1),草酰乙酸一定會(huì)立即與乙?；惠o酶A反應(yīng),因此,草酰乙酸的濃度通常會(huì)保持在2如何保持TCA循環(huán)活性幾乎OM。檸檬酸酯生成直到琥珀酸( Succinate生成后TCA循環(huán)的自由能變化在所有反應(yīng)中幾當(dāng)厭氧條件變化為需氧條件時(shí),兼性厭氧細(xì)乎是0或很大的負(fù)值,因此,這些反應(yīng)一定容易向菌立刻利用了O3。這就意味著TCA循環(huán)和電右側(cè)進(jìn)行。但從琥珀酸到延胡索酸( Fumarate),接子遷移鏈既使在細(xì)菌細(xì)胞中,在著,從蘋果酸( Malate)到草酰乙酸的反應(yīng)相反正值很大葡萄糖(10)SuFumarate+FA丙酮酸△G。=49.0KjK′=2.58×10(11) Malate+ NAD'->Oxaloacetate乙?；o酶ANADH+HK=6.22×10草酰乙酸檸檬酸鹽蘋果酸異檸檬酸鹽延胡索酸氧代戊二酸鹽復(fù)A琥珀酸琥珀酰輔酶A電他的外陽(yáng)圖1糖酵解作用和三羧酸(TCA)循環(huán)Fig. 1 Glycolysis and Tricarboxylic acid(TCA) cycle厭氧條件下也能保持它們的性質(zhì)。但TCA循環(huán)圖2氧化還原電勢(shì)與PH值的關(guān)系在厭氧條件下不活潑,而代謝作用要通過(guò)發(fā)酵才Fig 2 Reduction-Oxidation potential vs pH能進(jìn)行△G′。正值很大的反應(yīng),容易停止進(jìn)行,產(chǎn)物2.1TCA循環(huán)的自由能變化量很少因此,反應(yīng)(11)可以由很少量的草酰乙酸如圖1所示,TCA循環(huán)起因于乙?；惠o酶中國(guó)煤化工酸量由反應(yīng)(9)已保持A( Acetyl-CoA)和草酰乙酸( Oxaloacetate)反應(yīng)CNMHG有氧的條件下通過(guò)電產(chǎn)生的檸檬酸酯( Itrate)開始。因?yàn)檫@是乙?；舆w移鏈被氧氧化,因此[NADH/NAD+]的濃輔酶A和草酰乙酸之間等克分子反應(yīng),丙酮酸度比保持很小,這個(gè)反應(yīng)就不斷地從左向右進(jìn)行。分解為乙?；惠o酶A會(huì)受草酰乙酸量的制約。這就是為什么反應(yīng)(11)能向右進(jìn)行的原因(9)№數(shù)據(jù)。A+ Oxaloacetate+H2O對(duì)于氫氣生產(chǎn)來(lái)說(shuō)最值得注意的事情就是這第2楊運(yùn)嘉等:生物質(zhì)細(xì)菌制氫種反應(yīng)甚至可以在厭氧條件下進(jìn)行。按照NADH其功能。因此,應(yīng)當(dāng)將FADH2快速氧化,對(duì)循環(huán)釋放H2的歷程,質(zhì)子接收電子成為來(lái)自NADH來(lái)說(shuō),FADH2[FAD]濃度比必須保持相當(dāng)小。細(xì)胞膜側(cè)的H2。如果保持大約5的低PH來(lái)獲得有機(jī)體在有氧的條件下,通過(guò)把電子輸送給有很如圖2所示的高H2H氧化還原電勢(shì),為了進(jìn)行高標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電勢(shì)(0.818V)的氧氣而解決了氫氣生產(chǎn)循環(huán),可以制造足夠大的[草酰乙酸]/這個(gè)問(wèn)題,見反應(yīng)式(8)蘋果酸]濃度比可見,[FADH2J/[FAD]比的確是TCA循環(huán)的關(guān)鍵。三額環(huán)電子遷移鏈抑制劑3電子遷移鏈和抑制作用琥珀酸說(shuō)氫藤NADH+HE032v從上面分析已經(jīng)清楚,怎樣氧化FADH2對(duì)于TCA循環(huán)來(lái)說(shuō)是最重要的問(wèn)題。即NADH被FADHz魚藤啊、父密妥NADH兒茶紫氫氣產(chǎn)生重新氧化時(shí),要用氧來(lái)重新氧化配郵月桂陪鹽FADH2。氧錄( chlonmereun電子遷移鏈?zhǔn)怯醚踔匦卵趸疐ADH2和NADH的酶體系。電子遷移鏈的酶類對(duì)所有微生E=022V物來(lái)說(shuō)是不相同的,該文所述線粒體( Mitochondria)的電子遷移鏈?zhǔn)怯扇鐖D3所示的4種酶絡(luò)合胞色盒抗近A物組成的。因?yàn)镹ADH在有氧的條件下會(huì)被氧重bc絡(luò)合物新氧化,為了產(chǎn)氫應(yīng)當(dāng)抑制NADH的重新氧化幸而,酶終合物對(duì)于NAD的活潑性不同于對(duì)細(xì)胞色素cFAD,因此,抑制位置應(yīng)當(dāng)是NADH脫氫酶絡(luò)合物。從如下反應(yīng)可見,最高可得到10mol氫氣(12)C6H12 O+lONAD++2FAD+4ADP+絡(luò)合物6HO—→10NADH-+10H++2FADH, +6CO2+4ATPO2Eo=+0.82v(13) 2FADH,+O,+ 4ADPFAd+2H,O+4ATP(14)10NADH+10H+-→10NAD++10H圖3線粒體的電子遷移鏈(15)C6H12 O+ 8ADP+O2+4H,O----10HFig 3 Electron transport chain of mitochondria+6CO,+8ATP2.2[FADH2/[FAD比是延胡索酸釋放的關(guān)鍵如圖3所示,許多抑制劑對(duì)電子遷移鏈的酶反應(yīng)(10)(從琥珀酸到延胡索酸)是FAD參絡(luò)合物都會(huì)起作用。使用抑制劑后如果觀測(cè)到加的一種反應(yīng),具有其特性例如不僅平衡常數(shù)非TCA循環(huán)仍在進(jìn)行的話,NADH脫氬酶就被抑常小(K′。=2.58×10-),而且有相當(dāng)高的標(biāo)準(zhǔn)氧中國(guó)煤化工化還原電勢(shì),延胡索酸/琥珀酸和FAD/FADH2CNMH對(duì)分別為+0.03V和一0.21V。即使FADH1的4生物刑氫及厘益及流程濃度變得稍高,例如[FADH2]/[FAD]=1×10ˉ3,延胡索酸]/琥珀酸]比非常小,為10-°,因生物質(zhì)制氫反應(yīng)分為間歇式和連續(xù)式兩類,而延胡索彤婆度變得相當(dāng)小。結(jié)果,蘋果酸的就產(chǎn)氫率看連續(xù)式的要高得多圖4是連續(xù)式制濃度也變得相當(dāng)小,最后,TCA循環(huán)停止以保持氫系統(tǒng)的簡(jiǎn)易流程圖云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)1s}一3圖4生物質(zhì)制氫簡(jiǎn)易流程Fig 4 Schematic diagram of the biological h圖中數(shù)字表示:1、進(jìn)料罐泵,罐中盛無(wú)菌介質(zhì):2、偏薆型墳料固定床生物反應(yīng)器,將固體基質(zhì)(任何農(nóng)林廢料)墳入該反應(yīng)器,經(jīng)預(yù)處理使細(xì)菌細(xì)胞固定在基質(zhì)上;3、發(fā)酵漿收集器;4、沉降槽,氣液在此分離;5、CO2吸附器,內(nèi)裝CO2吸附劑,CO2在此被吸附;6、H2收集器,H2在此用排水取氣法收集;7、盛液罐參考文獻(xiàn):在此要說(shuō)明的是為何要采用偏菱型生物反應(yīng)器,若采用園柱型反應(yīng)器會(huì)存在氣體滯留問(wèn)題,其實(shí)1] Tanisha.S,andY, Ishiwata, Continuous hydrogen質(zhì)就是降低了反應(yīng)器的有效工作容積,產(chǎn)氣量相production from molasses by the bacterium enter應(yīng)降低。而偏菱型反應(yīng)器相對(duì)于園柱型反應(yīng)器氣bacter aerogenes, Int, J, Hydrogen Energy, 19,807體滯留量可減少60~70%,同時(shí)這種反應(yīng)器的收812(1994)縮擴(kuò)張構(gòu)形會(huì)使物流產(chǎn)生高度擾動(dòng),使細(xì)胞與基[2 Miyake, J, X.X. Mao and S. Kawamura, Hyd質(zhì)有較好的相互作用,從而提高產(chǎn)氫率。gen photoproduction from glucose by co-culture of anthetic bacterium and clostridium butyricumJ Ferment Technol.,62,531(1984)結(jié)論[3 Tanisho, S, in BioHydrogen, ed, O. RZaborsky, Hydrogenproduction by Facultative對(duì)H2生產(chǎn)來(lái)說(shuō),從葡萄糖得到的氫產(chǎn)量,通Anaerobe Enterobacter aerogenes, plenum press, p過(guò)使用有氫化酶的需氧或厭氧細(xì)菌將提高至273-279,199810mol-H1/mol-CH1O。為了獲得這個(gè)最高產(chǎn)4] Rachman,M.A, Nkashimada,nY, Makizono,T量,應(yīng)當(dāng)使用諸如氧這類具有高氧化還原電勢(shì)的and Nishio, N., Hydrogen production with high電子受體,抑制電子遷移鏈的NADH脫氫酶絡(luò)合cells of Enterobacter aerogenes in a packed-bed re-物,但在電子遷移鏈上要有酶絡(luò)合物來(lái)重新氧化pI. Microbiol BiFADH2以保持TCA循環(huán)。1998在反應(yīng)體系上最好采用連續(xù)式流程,使用偏[5] Kumar,N. and Das,D., Enhancement of hydrogen菱型反應(yīng)器以獲得較高的H2產(chǎn)量。production by Enterobacter cloacae T- BT 08TH中國(guó)煤化工589-593,1999CNMHG第2期楊運(yùn)嘉等:生物質(zhì)細(xì)菌制氬hydrogen production from biomasses by bacteria fermentationYANG Yun-jia, HU Zhi-hua( Energy and Environment Institute, Yunnan Normal University, Kunming 650092)ABSTRACT Enterobacter was immobilized on lignocellulosic material such as rice(beet dregs and coir etc. as solid matrices with adsorption technique the production of hydrogen by fermentation were discussed in this paper. For obtaining maximal yield of hydrogen how to make glycolysis toproduce large amount of Nadh at TCa cycle and also to reoxidize FADH2 through electron transportchain by oxygen or other electron acceptors were chief introduced. This method is effective to the facultive anaerobic bacteria or aerobic bacteria with hydrogenaseKEY WORDS Hydrogen production; fermentation; Enterobacter: TCA cycle; electron transport chain;inhibition中國(guó)煤化工CNMHG