用與環(huán)境生物學報2009,15(4x59-5622009-08-25Chin J Appl Environ Bio/=/SSN 1006-687XDOⅠ:10.3724SPJ.1145.200900559株乙醇利用菌的分離及其在乙醇含量測定中的應用陳亮鄭軍張益霞趙翠翠何雨原溫廣明楊素萍趙艮貴山西大學生物技術研究所化學生物學與分子工程教育部重點實驗室太原030006摘要從山西清徐農用沼氣池中分離得到一株能以乙醇為唯一碳源和能源生長的菌株ME45,通過生理生化特征及16 S rDNA序列分析,將ME45鑒定為嗜有機甲基桿菌 Methylobacterium organophiliun).依據(jù)ME45能在有氧條件下利用乙醇的特性,因此以固定化細胞和溶氧儀組成測定系統(tǒng)測定了不同含量乙醇的響應時間以及溶氧變化與乙醇含量的關系結果表明,乙醇含量在0.02%~-2%(W∽)范圍內,響應時間小于25min,溶氧消耗量同乙醇含量呈函數(shù)關系,擬合系數(shù)(R)為09947.干擾實驗結果表明,該測定體系具有較強的選擇性,待測乙醇樣品中其它醇類物質含量不高于乙醇含量5倍對乙醇測定無干擾.以95%乙醇為樣品進行多次測定,測定平均值為918%,RSD為3.5%,表明該反應體系重現(xiàn)性良好.本研究為進一步研究乙醇微生物傳感器奠定了基礎.圖7表1參15關鍵詞乙醇;嗜有機甲基桿菌;測定;電化學CLC Q939,9Isolation of An ethanol-utilizing strain and Its applicationin determination of ethanolCHEN Liang, ZHENG Jun, ZHANG Yixia, ZHAO Cuicui, HE Yuyuan, WEN Guangming,YANG Suping ZHAO(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University. Taiyuan 030006, China)Abstract a bacterial strain ME45 which uses ethanol as the sole carbon source for growth was isolated from a family biogasdigester in Qingxu of Shanxi Province, China. Based on the physiological characteristics and 16S rDNA sequence analysis,strain ME45 was identified as Methylobacterium organophilium. Response time and the relationship between consumptionof dissolved oxygen and different ethanol contents were studied with PVA-H, BO, immobilized cell of ME45 usingelectrochemical method. It was shown that the response time of the ethanol detection system was about 25 min for 0.02%-2%(/n)ethanol, the dissolved O, consumption increased with the increase in ethanol content, demonstrating a correlationalrelationship, with the correlation coefficient 0.994 7. Furthermore, the interference test and the detection of ethanol sample bothobtained satisfactory results. This work highlights the potential of this bacterium for monitoring ethanol, Fig 7, Tab l, Ref 15Keywords ethanol; Methylobacterium organophilium; determination; electrochemistryCLC Q9399乙醇俗稱酒精,是無色透明、易揮發(fā)和易燃燒的液體,析方法的報道,但仍處于實驗室硏究階段氐.因此,尋找簡是重要的有機化工基礎原料,廣泛應用于化學工業(yè)、醫(yī)療便、快速、準確和應用廣泛的乙醇分析方法倍受重視衛(wèi)生及工業(yè)合成等各領域.隨著礦物能源的大量開采和消上世紀80年代已有微生物法測定醇類物質的報道,基耗,乙醇作為化石能源替代品將發(fā)揮重要作用叫因此,在釀本上都以醇脫氫酶和微生物細胞作為分子識別的元件7,酒、制藥、發(fā)酵和合成工業(yè)產品、化妝品等工業(yè)應用領域以從這些研究報道的結果來看,都存在壽命短、選擇性和穩(wěn)定及環(huán)境保護工作中準確、快速地檢測乙醇含量具有重要的意性差等缺點,仍處于研究階段,尚未達到應用水平我國目前義乙醇測定的常用方法主要包括比重法、比色法、氣相色譜在這方面研究較少,僅有孫裕生等報道了一種乙醇細菌電極法和液相色譜法比重法操作簡便,可用于高含量乙醇測的制備,制備簡便,并初步用于樣品檢測,但檢出限和檢測范定,但對乙醇測定特異性差叫比色法,如重鉻酸鉀比色法和圍無法滿足乙醇測定發(fā)展的要求,且測量過程中易受其它醇碘量法,顯色緩慢且不穩(wěn)定,受多種因素干擾,操作較為繁類物質干擾咧;而且所用菌株尚未明確鑒定,其代謝機理也瑣色譜法能檢測微量乙醇,精密度和準確性很高,但儀器昂不甚清楚.目前,國內外微生物法測定乙醇的報道較少,而且貴、操作和維護繁瑣.而且色譜法和比色法也無法進行戶外檢測.另外,還有紅外光譜、熒光和激光拉曼光譜等乙醇分多處于實驗室研究階段.因此,深入開發(fā)可適用于乙醇檢測的微生物資源并應用于乙醇含量的測定具有重要的意義.我們從山西清徐農用沼氣池中分離得到一株以乙醇為唯一碳源收稿日期:2008-06-02接受日期:2008-09-12生長的菌株,依據(jù)其生理生化特性和16 S rDNA序列分析,該國家自然科學基金重點項目(No.50534100資助 Supported by the Key菌株被鑒定為甲基桿菌 Methylobacterium organophiliun),并Project of the National Natural Science Foundation of China*通訊作者Correspondingauthor(E-mai:chungui@sxu.edu.cn)利用電化學方法,在微生物作為識別元件的測定體系中,初560應用與環(huán)境生物學報 Chin J Appl Environ Bio15卷步研究了不同含量乙醇對溶氧的響應時間以及溶氧變化與儀(CI-6542, Pasco Scientific,USA)檢測體系溶氧變化,記錄乙醇含量的關系,以期為乙醇微生物傳感器的研制提供思路溶氧值.和材料材料與方法11材料11.1樣品來源微生物分離的水樣采集于山西清徐農用沼氣池1.1.2培養(yǎng)基①液體培養(yǎng)基:每升含KH2PO40.5g,Na, HPO, 0.5 g, NaCI 0. 4 g, KNO, 1.0g, NH,CI 0.5 gMgSO4 7H, o 1.0 g, CaC1,0.2 g, FesO, 7H, 00.004 gCuSo, 5H,O 0.4 mg, MnSO H,O 0.4 mg, ZnSO.7H,O 0. 4 mgNaMoo2H2O0.24mg; CH COOH6mL.②2固體培養(yǎng)基:含有2%瓊脂液體培養(yǎng)基.圖實驗裝置示意圖113主要試劑:聚乙烯醇(PVA9950;rg酶、引物合成1恒溫水浴:2緩沖液進樣口乙醇進樣口:4溶氧電極:5溶氧響應儀劑均為國產分析純I. Thermostat water bath cauldron; 2. Inlet port; 3. Ethanol inlet port: 4Dissolyed o. electrode 5 dissolysensor: 6. Outlet port: 7. Gas vent1.2富集與分離以5%接種量將采集水樣接入盛有100mL液體培養(yǎng)基的1.8測量條件的選擇600mL鹽水瓶中,于120rmin搖床,30℃培養(yǎng),菌液渾濁后以消耗溶氧為指標,分別測定了溫度、pH和NaCl濃度對再次轉接進行富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)物經固體瓊脂培養(yǎng)基平板固定化細胞利用乙醇消耗溶氧的影響劃線進行菌株分離19響應時間的測定1.3個體形態(tài)與培養(yǎng)物特征的觀察菌體染色后在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)在固定瓊脂胞,開始測定并記錄溶氧變化.開始測定到溶氧下降達到平培養(yǎng)平板上觀察菌落特征衡的時間即為乙醇測量的響應時間14碳源利用1.10標準曲線的測定離心收集液體培養(yǎng)的菌體細胞,經無菌水洗滌后,接種配制乙醇濃度分別為0.02%、0.05%、0.2%、0.4%、0于含有20mL液體培養(yǎng)基的130mL鹽水瓶中,液體培養(yǎng)基中6%、1%和2%()對標準樣品,分別加入測定體系中測定并分別添加不同種類和濃度的碳源,觀察細菌生長情況記錄相應的溶氧消耗量,繪制標準曲線1.516SDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析111千擾物濃度及實際樣品的測定提取細菌基因組DNA,以5’- AGTTTGATCCTGGCTCA在0.4%(W)乙醇樣品中含有不同濃度的干擾物,分別-3和5’·T^ ACCTTGTTACGA CTTCA3”為引物,進行16 S TDNA測定不同干擾物濃度對乙醇含量測量值的影響,以每種干擾PCR擴增擴增條件為:94℃3min;94℃Imin,60℃45,物濃度對測定值的影響不超過±5%為標準,進行干擾物質及72℃1min,循環(huán)30次;72℃10min.PCR擴增產物,經克隆濃度的評價后送上海生工測序.測序序列經 BLAST比對,在 Gen Bank和以95%乙醇(北京化工廠生產)和山西杏花村汾酒集團質EMBL等數(shù)據(jù)庫搜索與該序列相似性較高菌株的序列,進行檢處提供的汾酒生產過程中d7和d15固態(tài)發(fā)酵物的浸提液Clustal x多序列比對,再從MEGA31軟件包中選用 Neighbor-為實際樣品,分別編號為1、2和3.以本實驗方法和氣相色譜Joining(NJ)、 Algorithm和 Maximum Parsimony(MP方法構建法分別進行乙醇含量測定,氣相色譜儀為GC9800型氣相色系統(tǒng)發(fā)育樹,用 Bootstrap對系統(tǒng)樹進行統(tǒng)計檢驗譜儀(上?？苿?chuàng)色譜有限公司),檢測器為氫火焰檢測器,按16固定化細胞的制備及活化外標法以峰面積計算乙醇含量.后,稱菌體濕重稱取PVA,加熱攪拌溶解,配制0%PA溶2結果與分析液,冷卻到35℃左右,加入預溫的濕菌體,其中菌體含量為2.1菌株的分離及鑒定3%w/1),混勻,將其滴入pH60飽和硼酸溶液中過夜,蒸餾經兩次富集培養(yǎng)和反復平板劃線分離獲得菌株ME45水洗滌,4℃保存該菌株在不含乙醇的對照培養(yǎng)基及含有乙醇無氧條件中均不活化:每次使用前將適量的固定化細胞放入盛有100生長,而在含乙醇的培養(yǎng)瓶中細菌生長良好表明ME45能利mL液體培養(yǎng)基的600mL鹽水瓶中,在轉速為120rmin搖床中用乙醇同時消耗氧氣,ME45在固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)4d,見30℃活化1h圖2,菌落直徑0.6-1.2mm,粉色,圓形,稍隆起,邊緣光滑,17測量裝置及方法較濕潤,不透明.細胞顯微觀察見圖3,細胞短桿狀,0.8μmx如圖1所示安裝測量裝置,恒溫水浴控制測量體系溫10μm,革蘭氏陰性,無莢膜和芽孢度,將2mL的測試樣品加入18mL的反應體系中,關閉裝置的ME4516 S rdNA序列 Genbank登錄號為EU567067通氣口,待體系溶氧平衡后置入固定化細胞.通過溶氧響應16 SrNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析見圖4,ME45位于 Serine途徑期陳亮等:一株乙醇利用菌的分離及其在乙醇含量測定中的應用圖2ME45菌落照片F(xiàn)ig. 2 The photo showing of the colony of ME451015202530353ME45顯微照片(×1000Fig 3. ME45 in microscope (x1000Methvlobacteriun進化分枝上,與M. luteus 16sDNA序列同源(NaCI)mol L性最高.ME45初步被鑒定為甲基桿菌屬( ethvlobacterium)5溫度、pH和NaCl濃度對固定化細胞消耗溶氧的影響生理生化測定結果表明,ME45氧化酶和接觸酶為陽性;能利 Fig 5 Effects of temperature, pH and NaCl concentration on consumption用葡萄糖、果糖、乙酸鈉、乙醇、甲醇、甲烷和甲基胺;不能of dissolved oxygen of immobilized cells刂用癸二酸鈉、甜菜堿和酒石酸鉀鈉.根據(jù)形態(tài)特征、生理線見圖6,加入固定化細菌后,體系溶氧迅速下降,隨著乙醇生化特征和16 SrnA序列分析,ME45被鑒定為甲基桿菌屬含量的增加,相對溶氧達到平衡的時間有所延長,溶氧消耗的嗜有機甲基桿菌(M. organophilic)12量增大.乙醇含量在0-2%(V)范圍內響應過程在25min內Mlethnwoicrobium sp. ATCC 35068(EU144026達到平衡Methnlasarcina lacIs(AYO07296)24乙醇測定的標準曲線Alethnlomonas rubra NCIMB 11913(AF3041乙醇含量與溶氧消耗量的關系曲線見圖7.測定體系中乙醇含量增大,細菌對溶氧的消耗量增多,以乙醇含量對相Methylocalchm sp ( DQ496233應的溶氧消耗量作圖,經曲線擬合測定體系溶氧的消耗量(y)與乙醇的含量(x)在002%-2%(W)范圍內呈函數(shù)關系,其擬100[ Strain ME4S (EU567067)合方程為y=14-1.3498,擬合系數(shù)(R2)為0.9947,經計算Merhylocela sd/vestris(AJ491847)檢出限為1.15×104Aetiyfocapsa acidip/la(J2787262.5干擾物濃度的測定Met/n oocystis sp (AF 150790)在04%乙醇的測量體系中分別含有不同濃度的干擾物Methylasinucs trichasparium(Y18947)質進行測量,干擾物質允許的濃度范圍分別以樣品中乙醇濃4菌株ME4516 SrNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析度的倍數(shù)表示:甲醇、丙醇、丁醇、甲酸、乙酸、乙酸鈉和氨Fig 4 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequences of strain ME45Numbers at the nodes indicate the bootstrapvalues on neighbor-joining基酸等為5倍,苯酚為0.1倍,葡萄糖、麥芽糖和果糖為7倍anaylsis of 1 000 resampled data sets. Bar 0.022 represents sequence divergence2.6樣品含量的測定22測定工作條件的選擇進行實際樣品的測定以考察系統(tǒng)的準確性和重復性.將由于ME4能夠利用乙醇消耗體系溶氧,測試體系的溫準曲線的測定范圍,并進行多次測定,結果見表1,本實驗方度、pH和NaC濃度是影響微生物催化底物反應活性、底物法的測定值與氣相色譜的測定值相一致和溶解氧擴散的主要因素.因而在0.05molL磷酸緩沖液中,選用3g固定化細菌,在設計的實驗裝置上,對固定化細3討論胞利用乙醇消耗氧氣測定體系的溫度、pH和NaC濃度進行目前,普遍認為甲基細菌屬的細菌通過RuMP途徑進行了優(yōu)化,如圖5所示.因此,選擇溫度為23℃,含有0.5molL同化作用,屬于I型甲烷氧化菌,也有文獻報道具有 Serine途NaCl,pH6.8磷酸緩沖體系進行該菌株利用乙醇與消耗溶氧徑.l6 S TDNA探針技術已廣泛用于細菌的分類鑒定及生態(tài)關系的測定學研究,因此我們進行了甲烷氧化菌11個種屬及ME45系統(tǒng)發(fā)23響應時間的測定育分析,從圖4可以看出,11個種屬的甲烷氧化菌根據(jù)代謝途不同含量乙醇測量體系的相對溶氧()隨時間的變化曲徑的不同分為兩類,菌株ME45及所選 Methvlobacterium菌株562應用與環(huán)境生物學報 Chin J Appl Environ Bio15卷系溶氧量增加并波動,對樣品檢測和系統(tǒng)的溫度有重要影響,為簡化測量過程,該測定體系在無攪拌的靜息條件下進因而響應時間相對較長,實驗表明,該法測定乙醇具有操作簡便、專一性強、檢測范圍寬等優(yōu)點.關于該測量裝置微型化及檢測方法實現(xiàn)連續(xù)化,還需進一步進行研究eferencesFuQJ(傅其軍),SuY(蘇毅). The seemingly unfaltering growth of thethanol industry. Light Ind(廣西輕工業(yè)),2005(5):5-92 Tian Ys(田宜水) Zhao LX(趙立欣) Analysis fuel ethanol supply in圖6不同含量乙醇測量體系的相對溶氧隨時間的變化曲線China Energy china(中國能源),2007,29(12):26-19m22)0建樓Wmu任2mW偉mz傅志時Methods for determination of alcohol. Liquor Making(AR i), 2006, 331.2Wu XJ, Choi MME Spongiform immobilization architecture of ionotropypolymer hydrogel coentrapping alcohol oxidase and horseradishy=14-1.349e(8peroxidase with octadecylsilica for optical biosensing alcoholsolvent. Anal Chem,2004,76(15):4279-4285R2=0.99475 Wen GM, Zhang Y, Shuang SM, Dong C, Choi MMF. Application of abiosensor for monitoring of ethanol. Biosensors bioelectronics, 2007,522.523:121-129/%圖7乙醇含量與溶氧耗量的關系曲線6 Zhang hB(張洪波),SuDZ(宿德志),HeYL(何焰藍). A research onFig. 7 Relationship between dissolved oxygen consumption and differentfourier transform raman spectroscopy of mixed liquor of C, H, OH. Anal& Testing Techno!& Instrum(分析測試技術與儀器),2007,13(3)表1不同樣品乙醇含量的測定Table 1 Determination of ethanol in various samples7 Carelli D, Centonze D, Giglio AD, Quinto M, Zambonin PG. Aninterference-free first generation alcohol biosensor based on a gold本實驗方法 Our method氣相色譜Chromatography RE(o)electrode modified by an overoxidised non-conducting polypyrrole film.N Average(%)RSd(%) N Average(%)Anal Chim Acta. 2006. 565: 27-38 Wang XH(王曉輝),LiX(李新), Sun ys(孫裕生). Sun gh(孫國發(fā))0.8LiXH(李曉紅). Study of the ethanol microbial sensor.. Chem sensor(化學傳感器),1998,18(3:35-39位于Ⅱ型甲烷利用菌的進化分枝上,說明 Methylobacterium這9Lix(李新), Wang XH(王曉輝). Sun Ys(孫裕生) Study and個屬的甲烷氧化菌在進化上同Ⅱ型甲烷利用菌接近,與 Elenapplication on methanol bacterial electrode. Chin j anal chen(分析化等研究報道一致13,1學),199,27(3):281-284本實驗室分離到能以乙醇為唯一碳源生長繁殖的菌株10 Zhao GG(趙艮) Zheng J((鄭軍, Wen GM(溫廣明, Yang SP(素AE45,并鑒定為嗜有機甲基桿菌(M. organophiliun,據(jù)文獻萍), Dong c(董川). Isolation and characteristics of a methane-utilizing報道該類細菌具有醇脫氫酶,能夠在有氧條件下利用乙 strain and its application for determination of methane gas.Aca醇.因此,利用溶氧測定儀和ME45固定化細胞設計了簡單的Microbiol sin(微生物學報),2008,48(3):398-402裝置,進行乙醇含量測定的實驗.ME45采用乙醇為唯一碳源Wen GM, Zheng J, Zhao CG, Dong C, Choi MMF. A microbialsing system for培養(yǎng)后,對乙醇利用有較強的專一性,以固定化該菌株進行Technol,2008,43:257-26l了乙醇含量測定,測定結果表明該測定體系不受其它醇類物12 Dong XZ(東秀珠, Cai my(蔡妙英) The Common bacteriun質干擾,具有較好的選擇性.這也說明該菌株胞內的乙醇脫Systematic Determinative Manual. Beijing, China (t: Science氫酶對乙醇分子的識別和催化有較強的專一性.乙醇含量在Press.2001.145~155002%-2%(W)范圍內,溶氧消耗量同乙醇含量呈函數(shù)關系,13 Hutchens E, Radajewski S, Dumont MG, McDonald響應時間在25min內;該測定方法在選擇性和專一性方面明Analysis of methanotrophic bacteria in Movile Cave by stable isotope顯優(yōu)于密度比重法,與色譜法相比具有成本低、操作簡便等probing Environ Microbiol, 2004, 6(2): 111-120優(yōu)點該生物反應系統(tǒng)的測試范圍為002%2%(W),通過4 Liang ZB(梁戰(zhàn)備)ShiY(史弈,YueJ(岳進, Advances in the調整實際測試樣品的稀釋倍數(shù),可以在較大的范圍內測定乙research of methanotroph. Chin ecol(生態(tài)學雜志),2004,23(5醇含量,其靈敏度、檢出限及檢測范圍均優(yōu)于已有報道.對95%乙醇和山西杏花村汾酒集團質檢處提供的實際樣品檢15 Hanson RS, Hanson TE Methanotrophic bacteria. Microbio/ Rev, 19960(2):439-47測,測定結果與氣相色譜測定值相吻合.由于攪拌使反應體