第28卷第2期天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)Vol 28 No. 22008年4月Journal of Tianjin Normal University(Natural Science Edition)Apr.2008文章編號:1671-1114(2008)02-0031-04注銀熱解碳的抗菌機(jī)理研究才學(xué)敏,鄭津輝,趙杰(天津師范大學(xué)a物理與電子信息學(xué)院;b化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,天津300387)摘要:使用草蘭氏陽性繭——一金黃色葡萄球菌,對注銀熱解碳的擾菌機(jī)理作了探討分析.銀離子的注入能量為70keV,注入劑量分別為5X10,1X1016,5×10ion/cm2,用俄歇電子能潘(AES)和X射線光電子能譜(XPS對樣品表面進(jìn)行了薇觀分析,結(jié)果表明:材料表面形成了富銀屢;對注銀劑量相同的熱解碳,直接接觸的抗菌效果比其濾液的抗繭效果好,說明注銀熱解碳的抗菌作用是溶出的銀離子和未溶出的樹料表面絡(luò)合狀銀離子的共同抗結(jié)果,且殺酋以銀離子溶出為主關(guān)鍵詞:熱解碳;銀離子注入;抗菌機(jī)理中圖分類號:R318.08;0484.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:AOn bactericidal mechanism of pyrolytic carbon with silver implantedCAI Xuemin, ZHENG Jinhui, ZhAo Jieb. College of Chemistry and Life Science, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China)Abstract: By using Staphylococcus aureus which is a kind of Gram-positive bacteria the bactericidal mechanism of pyrolytic carbon with silver implanted is studied. Energy of silver ions implanted is 70 keV, and doses of that are 5104, 110, 5X10 ions/cm. By using auger Electron Spectroscopy and x-ray Photoelectron Spectroscopy thesurface microstructure of samples is analyzed. The results show that Ag-rich layer is formed on the surface of mate-rial. For the pyrolytic carbon samples with same dose of silver implanted the bactericidal effect of touching directly isbetter than that of its filtrate. It means that the dissolved silver ions and the complex silver ions on the surface ofmaterial resist bacteria jointly, and the dissolved silver ions play the more important roleKey words: paralytic carbon; silver ion implantation; bactericidal mechanism生物醫(yī)學(xué)材料是生物系統(tǒng)直接作用于組織或器因此熱解碳具有抗斷裂強(qiáng)度高和相對低的彈性模官的治療增強(qiáng)或替代的材料.因而須要滿足各種量,以及相當(dāng)好的耐磨和耐疲勞性能;(3)熱解碳具生物功能對材料理化性質(zhì)的要求,且不會(huì)因與生物有無刺激不致癌的特性拋光后的熱解碳涂層具有系統(tǒng)直接結(jié)合而減弱其功能和使用壽命.人工心臟致密不透性,不會(huì)引起降解反應(yīng);(4)熱解碳還具有瓣膜是指用機(jī)械或者生物組織材料加工而成的可以見的抗血凝性能可直接應(yīng)用于心血管系統(tǒng)這也用來代替病損心臟瓣膜功能的人工器件.目前由正是熱解碳十分流行的最主要原因.另外,銀作為一種優(yōu)良的抗菌劑,自古至今已有廣泛的應(yīng)用它于制造機(jī)械瓣葉最流行的材料是低溫各向同性碳在手術(shù)過程中及術(shù)后均能起到很好的抗菌作用2(LTIC),簡稱熱解碳.(1)醫(yī)用碳素材料與其他金本研究是在注銀熱解碳具有明顯抗菌性研究的屬材料相比,是一種化學(xué)惰性材料故熱解碳具有很基礎(chǔ)上(,對材料表面進(jìn)行AES和XPS的微觀分好的生物相容性在體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生對機(jī)體有害的離析,月中國煤化工果的測試,初步探子;(2)醫(yī)用碳素材料具有良好的“生物力學(xué)性能”,討了CNMHG收稿日期:2007-1基金項(xiàng)目:國家自然基金資助項(xiàng)目(10475061);天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(033607911)第一作者:才學(xué)敏(1983-),女,碩士研究生通訊作者:趙杰(1943-)男教授從事凝聚態(tài)物理、離子注入方面的研究. E-mail; jiezhao1943@126.cm32·天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2008年4月其2倍濃度的細(xì)菌懸液b.用微量加樣器取菌液a各1實(shí)驗(yàn)1mL,分別加入無菌真空盒(培養(yǎng)盒)的各孔中.再從1.1實(shí)驗(yàn)樣品的制備已滅菌的樣品組中各取半份量的樣品,分別放入已實(shí)驗(yàn)所使用的高純熱解碳人工心臟瓣膜,其中加菌液a的各個(gè)孔中并編號;用微量加樣器取菌液的S含量為0.01%石墨相含量為24%其他雜質(zhì)b各0.5mL,分別加入培養(yǎng)盒的各孔中,取步驟1)含量均小于0.001%.使用北京師范大學(xué)低能核物中的每組樣品濾液各0.5mL,分別加入已加菌液b理所研制的金屬蒸汽弧源( MEEVA)離子注入機(jī)進(jìn)的各個(gè)孔中并編號.行銀離子注入.樣品雙面注銀的編號和注入?yún)?shù)見3)把步驟2)中的培養(yǎng)盒放入轉(zhuǎn)速為150r/min表1.的搖床上,恒溫37°C,培養(yǎng)24h.衰1樣品編號及其注入?yún)?shù)4)用微量加樣器取與樣品及樣品濾液共培養(yǎng)后樣品編號R/mmE/kevI/mA注人劑量的菌液,從每個(gè)編號孔中各取0.1mL,接種于已滅(ion·cm-2)0菌的含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,每個(gè)編號樣品各3個(gè)平5×1014行操作,均勻涂布平板后,平放于實(shí)驗(yàn)臺靜置20~1X10165X101730min,使菌液滲人培養(yǎng)基表層內(nèi).將標(biāo)明相應(yīng)編號的培養(yǎng)皿放人37°C的恒溫箱里培養(yǎng)24h.1.2樣品結(jié)構(gòu)特征測試5)用體視顯微鏡觀察,并用數(shù)碼相機(jī)記錄培養(yǎng)1.2.1AES測試皿里的菌落數(shù),按下式計(jì)算各個(gè)樣品的抗菌率采用美國PHI公司生產(chǎn)的PHI-610掃描俄歇電子能譜儀,分析樣品表面的成分及薄膜成分沿深FA-B、×100%度的變化采用同軸電子槍和CMA能量分析器,其中,A,B分別對應(yīng)相同面積內(nèi)未注銀對比樣品其電子槍高壓能量為3kev能量分辨率為0.3%,和注銀樣品與細(xì)菌作用之后培養(yǎng)皿里的菌落數(shù)入射角30°,分析室真空度為52×10Pa.深度分析中離子束的濺射條件為:掃描型Ar離子槍,面積2結(jié)果與討論為1mm×1mm,濺射速率約為30nm/min,能量為2.1注銀熱解碳的結(jié)構(gòu)特征分析3.0keV,發(fā)射電流為25mA2.1.1AES分析1.2.2XPs測試樣品A3(注銀劑量為5×10ion/cm2)的銀隨利用美國PH公司生產(chǎn)的型號為PH15300X光深度分布的AES譜圖見圖1,曲折的曲線為實(shí)驗(yàn)測電子能譜儀對注銀劑量5×10ion/cm2熱解碳樣品量值,光滑曲線為高斯擬合后的曲線.由圖1可進(jìn)行表面元素分析的定性、半定量化學(xué)價(jià)態(tài)分析.看出銀的分布為非對稱的高斯分布,其最大濃度為分析室真空度優(yōu)于.3×10Pa,用于對樣品進(jìn)行清4.5%,注人深度為750mm左右.銀元素濃度的高潔和定量剝離的離子源的濺射速率為1nm/min,斯分布都向靶材表面發(fā)生了偏移,這主要是由于離Ar+能量為3.5kev,束流為25mA子注入時(shí)的濺射效應(yīng),使得靶材料表面向內(nèi)部有了1.3抗菌試驗(yàn)遷移從而使高斯分布相對向表面遷移,導(dǎo)致了注入采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行抗菌性能測試平板離子的非對稱高斯分布菌落計(jì)數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋,使其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞.取一定量的稀釋樣液接種到平板上,經(jīng)過培養(yǎng),由每個(gè)單細(xì)胞生長繁殖而形FT FilterExperment成肉眼可見的菌落,即每一個(gè)單菌落代表原樣品中一個(gè)單細(xì)菌.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù),根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出原樣品中所含的菌數(shù)5.本實(shí)驗(yàn)選用的菌種為金黃色葡萄球菌,具體步驟如下:1)從已滅菌的樣品組A,A1,A2,A中各取等M凵中國煤化工量樣品,加入磷酸鹽緩沖液(PBS)1mL,放在轉(zhuǎn)速CNMHG度分布圖為150r/min的搖床上,恒溫37°C,24h之后,將樣2.1.2XPS分析品取出,得到濾液圖2是樣品A3(注銀劑量為5×107ion/cm2)2)用PBS液稀釋原菌液分別制成細(xì)菌懸液a及表面的XPS譜圖.由圖2可知,熱解碳注銀以后第28卷第2期才學(xué)敏,等:注銀熱解碳的抗菌機(jī)理研究33·表面富銀,在能量為275eV處有很強(qiáng)的Cls峰對步驟(5)給出的公式計(jì)算各樣品的抗菌率(表2)應(yīng)熱解碳的基底;在能量375eV處對應(yīng)著較強(qiáng)的銀饔2各組樣品抗率的Ag3d峰.同時(shí),在600eV左右,還有Ag3p,樣品編號Ag3p3峰說明表面存在不同價(jià)態(tài)的銀,可能有AgAgO,Ag2O,Ag2CO等表明注銀樣品表面確實(shí)存AAAA02895在不同價(jià)態(tài)的銀,富銀的表面具有抗菌作用3×10°從表2可以看到,注銀熱解碳具有明顯的抗菌效果,且無論對于直接接觸還是間接接觸抗菌率均隨注銀劑量的增大而增大;對于注銀劑量相同的樣器2×10品,直接接觸的殺菌效果比間接接觸(濾液)的殺菌效果好;對于樣品A3無論直接接觸還是間接接觸,5X1殺菌效果均為100%可能當(dāng)注銀劑量達(dá)到一定程度,濾液中的銀離子可使等量的細(xì)菌全部殺死2.3注銀熱解碳的抗菌機(jī)理圖2樣品A3表面的XPS譜圖由上述抗菌試驗(yàn)結(jié)果分析可知,間接接觸的方式2.2抗菌試驗(yàn)結(jié)果也同樣具有較好的抗菌效果,說明注銀熱解碳的濾液2.2.1定性觀察與分析具有抗菌作用,即材料中溶出的Ag*起抗菌作用;對抗菌試驗(yàn)結(jié)果的部分照片如圖3所示于注銀劑量相同的樣品,抗菌材料直接接觸菌液比其濾液接觸具有更強(qiáng)的抗菌作用,說明注銀熱解碳直接接觸菌液時(shí),除了溶出的Ag+起抗菌作用外,材料表面未溶出的絡(luò)合狀銀離子也有抗菌活性;這些說明注銀熱解碳的抗菌作用是銀離子溶出抗菌和接觸抗菌共同作用的結(jié)果,且殺菌以銀離子溶出為主對于注銀熱解碳的抗菌效果直接與銀離子從熱解碳中的溶出有關(guān),溶出量的多少?zèng)Q定了抗菌效果對于一定注銀劑量的熱解碳銀離子的溶出量直接決定于熱解碳的微觀結(jié)構(gòu)和溶出時(shí)間.該材料表面的SEM形貌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明熱解碳表面為多孔的層A。對應(yīng)未注銀樣品狀結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)使材料的表面積增大,注入的銀更容A2對應(yīng)注入劑量為1×101ion/cm2的樣品易從材料中游離出來同時(shí)也擴(kuò)大了細(xì)菌與材料的接A3對應(yīng)注入劑量5X10ion/cm2的樣品A2對應(yīng)注入劑量為1×1016ion/cm2的樣品濾液觸面,因而具有很好的殺菌效果.通過24h和42h圖3對應(yīng)樣品A、A2、A2、A3的菌落圖片的樣品濾液殺菌效果對比,后者的抗菌效果明顯優(yōu)于前者.表明給予的溶出時(shí)間越長,抗菌效果越好由圖3可知,沒有注銀的樣品A。沒有抗菌效從生理學(xué)的角度研究銀離子的抗菌機(jī)理是一個(gè)果,可見有大量的菌落分布;樣品A2和A3均具有十分復(fù)雜的問題雖然人們已經(jīng)進(jìn)行過大量的研究很好的抗菌效果,且樣品A3的抗菌效果更好,幾乎但對殺菌的具體生理過程尚未全面了解.目前,主要看不到菌落.樣品A2的直接接觸和間接接觸A2有3種有關(guān)銀的抗菌機(jī)理(樣品濾液)均具有較好的抗菌效果,但直接接觸的第一種是銀離子溶出型抗菌機(jī)理.細(xì)菌在生存殺菌效果比間接接觸的殺菌效果好.在未注銀的對環(huán)境中當(dāng)銀離子濃度相對過高時(shí)會(huì)影響其生長繁照樣品A中細(xì)菌的存活性很好,在顯微鏡下看到殖,從而起到殺菌作用.初級的破壞作用體現(xiàn)在:當(dāng)?shù)恼吵淼陌咨镔|(zhì)是細(xì)菌新陳代謝旺盛的產(chǎn)物,而細(xì)菌V凵中國煤化工改變了正常的生注銀樣品則沒有,表明銀抑制了細(xì)菌的新陳代謝使物膜CNMHG離子濃度差從而其無法正常生長阻礙或破壞細(xì)胞維持生理所需的小分子和大分子物2.2.2樣品抗菌率的定量分析質(zhì)的運(yùn)輸.更深入的破壞作用體現(xiàn)在:當(dāng)微量銀離統(tǒng)計(jì)對應(yīng)各個(gè)樣品培養(yǎng)皿中的菌落數(shù),通過實(shí)驗(yàn)子到達(dá)細(xì)菌細(xì)胞膜時(shí)因細(xì)胞膜帶有負(fù)電荷銀離子·34天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)8年4能依靠庫侖引力牢固吸附細(xì)胞膜,與膜蛋白結(jié)合,導(dǎo)法逆轉(zhuǎn).這是因?yàn)榧?xì)菌不具備高等動(dòng)物完整的細(xì)胞致細(xì)胞立體結(jié)構(gòu)損傷產(chǎn)生功能障礙但細(xì)菌此時(shí)仍骨架及快速的修復(fù)功能,從而造成最終的損傷,具有一定的生命力;當(dāng)銀離子聚集量達(dá)到一定程度時(shí),它會(huì)穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,與蛋白質(zhì)、核酸3結(jié)論中存在的巰基(-SH)、亞氨基(一NH-)等含硫、1)由AES和XPS測試與分析得出,注銀熱解含氮官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng),甚至破壞或置換維持酶活力碳表面含微量銀且呈不同價(jià)態(tài)銀隨深度的分布為所必需的金屬離子,如Mg2+,Fe”和Ca2+等,使細(xì)非對稱的高斯分布,正是富銀的表面起著抗菌作用菌的蛋白質(zhì)沉淀或失去活性造成固有成分被破壞2)注銀熱解碳直接接觸的抗菌率和其濾液的抗或產(chǎn)生功能障礙而導(dǎo)致細(xì)菌死亡,當(dāng)菌體被銀離子菌率均隨注銀劑量的增大而增大;對于注銀劑量相殺滅后銀離子還可以從細(xì)菌中游離出來,又和其他同的樣品,抗菌效果前者較后者更好說明注銀熱解細(xì)菌作用.如此周而復(fù)始,使其具有持久抗菌性其反應(yīng)如下:碳的抗菌作用是溶出的銀離子和材料表面未溶出的絡(luò)合狀銀離子的共同抗菌結(jié)果,且殺菌以銀離子溶蛋白質(zhì)-SH+Ag蛋白質(zhì)-SAg↓+H出為主;當(dāng)注銀劑量達(dá)到一定程度,如樣品A3注入蛋白質(zhì)核酸-NH+Ag+劑量為5×10ion/cm2時(shí),兩者的抗菌作用是相同蛋白質(zhì)核酸-NAg++H+的,均為100%從外形上觀察細(xì)菌質(zhì)壁分離,細(xì)胞壁失去完整3)注銀熱解碳的抗菌效果直接與銀離子從熱解性和對滲透壓的保護(hù)作用,細(xì)胞膜破裂,組織液外碳中的溶出有關(guān),抗菌率與溶出時(shí)間成正比.此外,流,細(xì)菌凋亡,這源于菌體內(nèi)有大量中毒顆粒,可注銀熱解碳的多孔層狀結(jié)構(gòu),方便了銀離子的溶出能是菌體內(nèi)大量蛋白質(zhì)變性沉淀的結(jié)果和細(xì)菌的吸附,因而具有良好的抗菌效果第二種是銀的接觸抗菌機(jī)理.注銀熱解碳表面參考文獻(xiàn)是富銀層,由于Ag未飽和的配位能力,通過靜電吸[]盧水要,崔振懌,楊賢金,等.各種材料在人工心臟瓣膜中的附周圍環(huán)境中的細(xì)菌,與菌體表面的N或O作用應(yīng)用[].金屬熱處理,2004,29(9):23-破壞菌體表面活性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致菌體因生理變化或活2郭希銘,劉謙祥,唐慧琴,等銀離子注人對TN薄膜和熱解動(dòng)受阻而死亡,碳抗蘭性能的影響[冂].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,26(1):40-第三種是光催化抗菌機(jī)理.在光的作用下,材[3]劉棚,唐琴,張魁,等銀離子注入TN再膜的抗菌性和抗料表面的微量銀起到催化活性中心的作用,激活水腐蝕性研究[.天津師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,27(1)和空氣中的氧,產(chǎn)生羥基自由基(·OH)及活性氧離13-16.子(O),而活性氧離子具有很強(qiáng)的氧化能力,能在[4唐慰琴,鄭律輝,劉桐,等銀離子注人熱解碳的抗菌性研究幾短時(shí)間內(nèi)破壞細(xì)菌的增殖能力,致使細(xì)胞死亡,從而真空科學(xué)與技術(shù)學(xué)報(bào),2006,26(2):93-97達(dá)到抗菌的目的.因?yàn)殂y離子本身并不消耗,只起催[5]沈萍,范秀容,李廣武微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(3M北京:高等教育出版社,1999:93.化劑的作用,所以也具有持久的抗菌效果[6]夏金蘭,王春,劉新星抗菌劑及其抗菌機(jī)理[幾中南大學(xué)學(xué)報(bào)此外,銀的抗菌作用與自身的化合價(jià)態(tài)有關(guān),抗自然科學(xué)版,2004,35(1):31-37菌能力按下列順序遞減:Ag+≥Ag+≥Ag+.蛋7]馬玉龍,許樣榮離子型無機(jī)抗菌材料研究進(jìn)展材料導(dǎo)報(bào),白質(zhì)以膠體的形式在菌體中存在,高價(jià)銀離子比低04,18(2):16-18.價(jià)銀離子使膠體凝聚的效率大,蛋白質(zhì)沉淀也就更[8] Feng Q L, Wu J, ChenGQ, et al a mechanistic study of the anti-cterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococus容易,抗菌作用也越強(qiáng).此外,高價(jià)態(tài)銀的還原勢極aureus]. J Bomed Mater Re, 2005, 26: 662-668高并容易使體系產(chǎn)生原子氧,產(chǎn)生高效抗菌作用.[9]廁祚萬,楚瓏晨,段小飛無機(jī)抗菌材料的產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀[門新材曾用小鼠成纖維細(xì)胞L929作過注銀熱解碳的細(xì)料產(chǎn)業(yè),200,36:20-23胞毒性研究試驗(yàn)表明銀離子對細(xì)胞的毒性很小,為[10]唐篡琴,劉欣,劉桐,等注銀熱解碳生物相容性的研究U10級或1級,這對高等動(dòng)物來說,可以認(rèn)為是無毒功能材料,2006,37:680-683.[11]的.然而,對于細(xì)菌卻表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗菌性,目前已有中國煤化工au]. Nature Medicine研究者在沙門氏菌和大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)抗銀基因1CNMHG這些基因表達(dá)的最終產(chǎn)物大多是膜蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)整2scterial silver resistance: Molecular biology and系統(tǒng)的控制下完成對銀離子的綁定搬運(yùn),最終將銀ses and misuses of silver compounds [J]. FEMS MicrobiologyReviews,2003,27:341-353.離子排出胞外.但是,銀離子的強(qiáng)抗菌作用,依然無(責(zé)任蝙校李宏偉)