第36卷第6期湖北畜牧獸醫(yī)Vol 36 No 62015年6月Hubei Journal of Animal and Veterinary SciencesJune 2015重組豬α干擾素的聚乙一醇修飾研究李增,趙俊,王明麗(安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室,合肥230032)摘要:采用分子量為20kD單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEG-SC)修飾重組豬α干擾素,初步研究了修飾反應(yīng)條件及分離純化工藝。結(jié)果表明,單修飾PEG-IF№α的轉(zhuǎn)化率達(dá)到65%,單修飾產(chǎn)品ε度達(dá)到97%。由于修飾產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量和不均一性的增加,導(dǎo)致其體外杭病毒活性降低,抗病毒活性保留達(dá)到未修飾重組豬α干擾素的29%,仍然具有良好的抗病毒作用。關(guān)鍵詞:聚乙二醇;重組豬α干擾素:修飾中圖分類號(hào):S828文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1007-273X(2015)06-0005-02PEG(聚乙二醇)是一種中性、水溶性、無(wú)毒性的本研究采用分子量大、反應(yīng)條件溫和的20k△聚合物。在水溶液中長(zhǎng)鏈的PEG分子,具有高水合單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(μ∏IEr-∑X)性,可以附著到其他分子和表面上,提供了一個(gè)生物修飾劑對(duì)重組豬α干擾素進(jìn)行了修飾(圖1),并通相溶的、保護(hù)性外殼。這種保護(hù)性外殼降低了生物系過(guò)控制反應(yīng)條件期望獲得半衰期更長(zhǎng)、更穩(wěn)定,且統(tǒng)對(duì)這些材料的清除能力,極大的降低了蛋白質(zhì)細(xì)體外活性保留較高的∏Er化重組豬a干擾素產(chǎn)物。胞和細(xì)菌的吸附降低了腎臟的清除率。PEG在水和且對(duì)該單修飾產(chǎn)物進(jìn)行了純度、體外抗病毒活性進(jìn)許多有機(jī)溶劑中可溶,在水溶液中它和其他聚合物行了檢測(cè),為進(jìn)一步考察其藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性如葡聚糖一起可形成雙相系統(tǒng)。雙功能PEG的水溶質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。性、無(wú)毒性、高柔性和特征明確的化學(xué)特性,使它成為理想的修飾蛋白類產(chǎn)品的交聯(lián)材料。PEG與干w-0oNProtein擾素的偶聯(lián)已廣泛應(yīng)用于用于臨床。如先靈葆雅公司開發(fā)的聚乙二醇化人干擾素α-2B(商品名,佩樂(lè)mPEG-SC能, PegIntron);羅氏公司開發(fā)的聚乙二醇化人干擾圖1 mPEG-SO與重組豬a干擾素反應(yīng)式素α-2βB(商品名,派羅先, Pegasys)等。已經(jīng)證實(shí)被偶聯(lián)后的干擾素生物學(xué)活性大部分得以保留同時(shí)1材料與方法免疫應(yīng)答極大地降低,血清半衰期也極大地得到了1.1試驗(yàn)材料延長(zhǎng)原料:單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯動(dòng)物a型干擾素對(duì)畜禽病毒性疾病具有較好的(mPEG-SC),重組豬a干擾素。防治效果。安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室采用基因儀器: Amersham Pharmacia公司的 AKT A Ex-工程技術(shù)克隆并表達(dá)了豬a型干擾素,并將實(shí)驗(yàn)室 poorer色譜系統(tǒng);北京六一儀器廠的DYY-Ⅲ-4穩(wěn)合格產(chǎn)品制成凍干粉針劑發(fā)送至安徽省多家養(yǎng)豬場(chǎng)壓穩(wěn)流電泳儀。進(jìn)行臨床試驗(yàn)。結(jié)果證明,該室研制的重組豬α干擾試劑:牛血清白蛋白;甲叉丙烯酰胺;丙烯酰素能有效治療豬病毒性疾病。對(duì)治療豬病毒性腹瀉胺、SDS;考馬斯亮藍(lán)R250;RRMI1640培養(yǎng)基;小有效率為835%,治愈率為639%。在該項(xiàng)目的基礎(chǔ)牛血清;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化純?cè)噭?。?對(duì)重組豬a干擾素進(jìn)行聚乙二醇化修飾,以獲得12試驗(yàn)方法長(zhǎng)效制劑,從而延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)循環(huán)半衰期、減少體1.21聚乙二醇-重組豬a干擾素的制備與純化內(nèi)清除率,減少給藥次數(shù)、降低動(dòng)物的應(yīng)激性、增強(qiáng)千擾素用5mmo/LpH3.0-50的磷酸二氫鉀緩沖療效降低用藥成本。作為新型獸藥的開發(fā)這一項(xiàng)目液稀釋到0.1mgmL;加入計(jì)算量的干擾素,用有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景,同時(shí)具有較高的社NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到80,按干擾素:mPEG為1:20會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。的物質(zhì)的量加入14量的 mPEG-SC,在0-4℃條件中國(guó)煤化工收稿日期:2015-04-06CNMHG基金項(xiàng)目:安徽省自然科學(xué)基金(1308085Qc53)作者簡(jiǎn)介:李增(1985-),男安徽穎上人,副教授,主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)方面的教學(xué)與科研工作湖北畜牧獸醫(yī)2015年下反應(yīng),隨后每間隔2h加入14量的mPEG-SC,加理,24h后吸棄,再分別接種100TCID0的vsV病入完畢后繼續(xù)反應(yīng)4h加入075m0M的甘氨酸1mL毒。結(jié)果表明,聚乙二醇修飾后的重組豬α干擾素能終止反應(yīng);隨后將上述反應(yīng)液用5倍量體積、濃度為夠明顯抑制wsV引起的細(xì)胞病變,通過(guò)效價(jià)測(cè)定50 mmol/L pH72的醋酸鈉緩沖液稀釋,然后上Su(表1),所得的單修飾產(chǎn)物活性保留達(dá)到了29%。perdex75 Highload制備型凝膠色譜柱(26mm×600表1干擾素抗病毒活性液洗柱后,用含05 mol/L NaCI的醋酸鈉緩沖液洗樣品效價(jià)mum活性保留率/脫,收集含PEG-干擾素的洗脫液,濃縮,SDS-PAGEUnmodified IFN電泳檢測(cè)。用 Superdex200對(duì)“(1)”中得到PEG化Mono-PEG-IFN29×10干擾素進(jìn)一步純化,洗脫液為pH7.2的醋酸鈉緩沖液(含0.2 mol/L naCl),用波長(zhǎng)為280mm的紫外吸3討論收檢測(cè),收集含PEG-干擾素的洗脫液,濃縮。蛋白質(zhì)分子中的氧基有較高的親核反應(yīng)活性,122SDS-PAGE電泳法對(duì)產(chǎn)物的檢測(cè)對(duì)濃縮的而含有氨基的氨基酸主要有Lys和氮末端的氨基各洗脫峰采用SDs-PACE電泳檢測(cè),分離膠10%,對(duì)大部分蛋白來(lái)說(shuō),通常賴氨酸含量比較高,因而賴濃縮膠5%。電泳結(jié)束后,將膠體固定(固定液:30%氨酸的氨基是最易被PEG修飾的位點(diǎn)③。酰基化甲醇5%乙酸)室溫?fù)u動(dòng)染色1h(染色液:0.05%考PEG里包括經(jīng)常使用的 mPEG-SC、mPEG-SS。其中馬斯亮藍(lán)、30%甲醇、5%乙酸);最后將膠體移人脫色自從9年代初開始開發(fā) mPEG-SC以來(lái),由于其與液(脫色液:1%戊二醛、30%甲醇、5%乙酸)中室溫?fù)u蛋白反應(yīng)時(shí)條件溫和,應(yīng)用的最多動(dòng)浸泡直至條帶清晰為止。本研究采用分子量為20000的單mPEG_SC對(duì)1.2.3蛋白濃度的測(cè)定以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn),按重組豬α干擾素進(jìn)行了修飾。干擾素與干擾素修飾Lowy法3測(cè)定濃縮后的蛋白濃度。產(chǎn)物之間的主要差別之一是分子量的差異,因此本1.2.4抗病毒活性的測(cè)定采用WISH-ⅤSV系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)采用凝膠過(guò)濾色譜分離純化聚乙二醇修飾重組檢測(cè)干擾素的抗病毒活性。豬α干擾素。這種分離模式是已經(jīng)用于工業(yè)化生產(chǎn),2結(jié)果與分析工藝成熟。利用該分離條件,我們成功的純化獲得聚乙二醇修飾重組豬a干擾素。此分離純化模式相對(duì)2.1聚乙二醇-重組豬a干擾素的制備與純化比較穩(wěn)定,回收率較為理想,一方面滿足了后續(xù)聚乙豬α干擾素的等電點(diǎn)在62左右,經(jīng)聚乙二醇二醇修飾重組豬a干擾素性質(zhì)研究的需要,另一方修飾后,等電點(diǎn)有所降低,因此可采用離子交換層析面為它走向工業(yè)生產(chǎn)進(jìn)行嘗試,希望能為聚乙二醇的方法對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。結(jié)果如圖2所示,修飾重組豬a干擾素產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)提供參考?？菇?jīng)SDS-PACE電泳檢測(cè)結(jié)果表明,修飾后產(chǎn)物分離病毒活性研究所得的修飾產(chǎn)品中IFN體外抗病毒活組分(聚乙二醇-重組豬α干擾素)呈單一條帶,純度性隨著修飾后相對(duì)分子質(zhì)量的增加而降低,但活性能夠達(dá)到97%。對(duì)條帶3反應(yīng)原液各組分經(jīng)光密度保留達(dá)到了29%,仍然具有良好的抗病毒活性。計(jì)算可知反應(yīng)修飾率能夠達(dá)到65%。在本研究中,實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件溫和可控,對(duì)氮端修飾率高,分離純化工藝簡(jiǎn)單,收率高,可獲得高純116KDa,→度高均一性的樣品,確定了定點(diǎn)修飾干擾素的先導(dǎo)66.2 KDa化合物,為后續(xù)開發(fā)研究工作奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn):[1] PASUT G, VERONESE F M State of the art in PEGylation:35 KDaThe great versatility achieved after forty years of research [J]J Control Release, 2012, 161(2): 461-472[2]趙俊,張俊玲,李增,等.重組豬干擾素a1凍干粉針劑對(duì)豬的安全性試驗(yàn)研究[J中國(guó)畜牧獸醫(yī),2014(1):195-19818.4 KDa[3]閆萍楊琦,王惠珍,等.改良 Lowry法和 Bradford法測(cè)定蚯蚓提取物中蛋白質(zhì)含量的比較[].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006(1):9-11.1. Maker;2豬干擾素;3反應(yīng)原液;4純化后產(chǎn)物[4]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部中國(guó)生物制品規(guī)程.一部[M].北京:中圖2重組豬α干擾素與聚乙二醇修飾國(guó)人口出版社產(chǎn)物的 SDS-PAGE[5]楊旭,貢中國(guó)煤化工比修飾研究進(jìn)展[J].中國(guó)當(dāng)22聚乙二醇一重組豬a干擾素抗病毒活性CNMHG對(duì)WSH細(xì)胞用不同劑量的修飾干擾素進(jìn)行處