生物技術(shù)通訊LETTEHS IN BIOTECHNOLOGYVuL.I4 No.3 May, 2003191文章編號:1009 -00202002)03-0191-03研究報告mRNA差異顯示條件的優(yōu)化唐明娟'，郭順星，申業(yè)，胡鳶雷2(1. 中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學藥用植物研究所，北京100094; .2.北京大學生命科學院蛋白質(zhì)工程與植物基內(nèi)工程國家重點實驗室.北京100871)摘要:運用優(yōu)化的mRNA差異顯示技術(shù)分離受內(nèi)生真菌誘導的差異基因。優(yōu)化差異顯示條件表現(xiàn)在增加錨定引物和隨帆引物的長度、改變PCR參效和再擴增程序.運用策染顯色等。應(yīng)用這些條件共獲得7個陽性差異片段。系來黨化的PCR程席|前逸35條差異帶,得到3個兩端均為隨機引物的差示片段。兩用優(yōu)化的PCR程序2, 52條差異帶中得到9條只能用錨定引物和隨機引物才能護增出的片段。地高辛標記的反向-Northem塞定為陽性后進行黨隆和測樂、PCR方法!所得的3個差示片段均無開放的閱讀框。PCR程序2得到7個差異表達的基囚中,2個為已知基因,5個為未知基因。因此可運用優(yōu)化的差顯技術(shù)分離差異表達的基因。關(guān)鍵詞: mRNA 差異顯示:聚合酶鏈式反應(yīng):鑲?cè)?反向-Northerm中團分類號: Q781文獻標識碼: AOptimization of mRNA differential displayTANG Ming -juan', GUO Shun- xing'，SHEN Ye, HU Yuan-lei2(1. Institute of Medieinl Plant, Chinese Acadeny of Medical Scienend Beijing Union Medical College, Bejjing 100094;2. Stale Key Laboraory of Prolein Engineering and Plant Molecular Biology, Peking University, Bejjng 100871, China)Abstract: Optinied mRNAs diferential display tehnique(D)) was used lo identify genes rgulaled by endopbytiefungi. By increasing the lengths of ancbored primer and random primner, modifying the provedures of PCR and re-amplification. und siver staining, seven positive dfferential fragments were obrained. In 35 PCR experinents (CRuetud 1), 3 dferentiall bands were ierifiede, which were amplied with abitary primes on both ends. While inPCR method 2.9 of 52 diferentiall bhands were re-umplied only wih arbinrary primer and random primer. Sequenceanalysis folowedl by revense-Northen blol wih DIG probed conimed prsitive difrentiall gene. The three difreretial genes had no ORF(open reading frane) in PCR metlod 1. Among seven difrnially expresed genes, two wereknown genes and five were unknown genes. So the optimized DD prolocol can bhe aplied to idenify difereniallyexpressed genes.Key words: mRNA dfferential display; PCR; silver staining; revese -NorthemmRNA差異顯示(mRNA diferential display)是PCR參數(shù)重新改進后獲得7個陽性片段?，F(xiàn)將結(jié)果近年來發(fā)展起來的用于研究基因誘導后表達變化的報道如下。有效方法。因其操作簡便、快速,一次能分析多個樣品而成為分離新基因的首選方法。但是,假陽性率高1材料和方法和重復性低的缺陷又使得此項技術(shù)的應(yīng)用受到一定程度的局限。為此,許多學者不斷努力,從引物的設(shè)1.1 植物材料計.PCR循環(huán)參數(shù)、非放射性標記.鑒定陽性片段的.福建金線蓮(A. roxburghii)組培 苗生長在1/2 MS 培養(yǎng)方法等方面進行改進和優(yōu)化,取得了較好效果。本研基l0d后接人已活化的內(nèi)生真菌AR-18川,25個光照下共培究果用前人所優(yōu)化的條件未能獲得陽性片段，而將苗養(yǎng)60 d收獲。對照則為同樣條件下不與內(nèi)生菌培養(yǎng)的無菌收稿日期:2003- 01-091.中國煤化工基金項目:國家自然科學基金資助項目(30270148):商等學校全國"wA .H-TdG、H-TC優(yōu)秀博+:學位論文作者專項資金資助項月(199950)(H代:MYHCNMH(二獻|3}合成隨機引物作者簡介:唐明娟(1972- ). 女，博七研究生聯(lián)系作者:郫順星E-nial:sxgao@hotmai.coDDI0 (CCCCCCGCCAAGC).DD20 (TGCCCAATTCTG192告rER NBorcHNoCTHNOLOGY Vol.14 No.3 May, 2003GICAT) .DD23(TGCCCCGCCCCATCC) .DD34(TCCGGA2結(jié)果ATTCTOGTGAC) .DD60(TCCCCATTCCGACTGT),1.3 cDVA第 一鏈的合成差異顯示分別得到35個(PCR方法1)和52個用CTAB汰提取禍建金線蓮RNAH.太除DNA的步驟參差示片段(PCR方法2):將這些片段再擴增后點膜.照Invingen公i試劑侖說明將進行取20μg總RNA樣品，進行反向-Northerm,最后分別得到3個(編號為AlK~加入40 U HNasoOITW.I U DNuse1.20 mmol/1. Tris-HCl(pH8.4). 2 nnul/1, MgCl、50 mmol/1. KCI.室溢放置1532、AR-33、AR-35)和7個陽性片段(AR-DD17.min,加人1 μl EDTA(25 mmol/.)于 65C處理10 inin 以終AR -DD19 ,AR -DD20.AR -D1)23 .AR -DD37、AR -止反應(yīng)。按照(DNA第一謎合成試劑盒說明(lvirogen)進行DD44、AR-DD47)。這10個片段測序后,發(fā)現(xiàn)方法1反轉(zhuǎn)永、反現(xiàn)體系20 μul, 包括5 μl經(jīng)DNasel處理過的總所得片段兩端均為隨機引物，此處只列出AR-3序RNA.0.5山10 mmol/I. dNTIP,2 μ H-TuMI (M 代表G、A、列。方法2所得7個片段5'端均為隨機引物,3'為C;1 1ug/lul).5.5 μl DEPC處理的水。于650.反應(yīng)5 min后立錨定引物.此處也只列一-個AR- DD20序列。具體序即冰浴，加入4 μl 5x第.鏈緩沖液,2 μl 0.1 uol/L. IYTT,列如下:1 μl RNuseOIT"， 42'C 2 min,加入1 μl Superseriptl 后.42C接著反應(yīng)50 min.升溫釗48C進行30 nin,70C終止反AlR-33:應(yīng)I0 min.TGCCGGAATTCCGACTGTCCAGGCGTCGATTCGCECA1.4 PCR擴增TCCCCTATCGTTCCACCCI6CAGICCTGCGCCCGG以錨定引物I-Tm.M及隨機引物(DD10.DI20.DD23.TCGGCTGCGCCGCGGAGCCGGAACACACACTCCTCDD34 .DD60)組成的I5組引物對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增.ATCAAACCCGCTGGACTAATCGCCCCCCACGTCCCCCTICTPCR反施所用錙定引|物與逆轉(zhuǎn)錄所用錯定引物相同.依次加.TACCTCGGCCCCICCAACAACTTGCGGATGACAGAGGA人下列反應(yīng)物:2 μl eDNA第-鏈反應(yīng)物.2 μ錨定引物1I-CGCCTCACCCCACGCGCTCTTCCAGATACCCACGC0GGATM (20 ug/(u1).2 μ隨機引物(20 ng/u1), 100 ummol/.GCCACCACAGGTTCCIGGATACTACACAGGACACIN;GCAATICTCCTTAATCCATTCATG0GCGTCACTAATTACATAACC;dN1TPC10 mmol/L).2 μl 10x PCR緩沖液.1.5 mmw/L MgCls .ACGCATTTCCCTACCTAACACAGICATACTTACTCCCCCC0.5"TauDNA聚合酶，補水至20μcPCR程序采用兩種方TTACCCCCTTGCTTAATTCTTCACTTTC 1CATTCAGAG;法。萬法I參照文獻[3].具體為:94C 1 min ,409: 4 min.729:CACTCGGCACAAATCACATCCCTCAGCACCCCTGGGACC1 min,1 個循環(huán):94C 45 s,60C 2 min.729. 1 nin,35 個循ATCGCAATCITTCTTTTAATAACAGTCGAATTCCGG環(huán):720: I0 min.4t.方法2為優(yōu)化方法:94C 5 min:94CCAATCACT30 s.40C 2 min,72C I min.25 個循環(huán):949: 30 8.50T 1AR-DD20):min,72C 1 min,10 個循環(huán);729C 10 min,4C。TGCCGAATTCTGGTCATTGACACTTTACTCCCTCTCG1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染ACATCTACATCCCGCAGAACAACATCACCCCAGGGAGGG按文獻[S]配制8%變性聚丙烯酰胺凝膠.聚合1 h后60GACGTCICGCCTCAAGTTCCTCACCTTCCTTCTTCW恒功率電泳5h。銀染參照文獻[6]進行,GICTCTTCC0OCCCTCAC0GGTCCATCCCCGACTTATT1.6 差異條帶的回收與再擴增CTCCACCTCAACTCCTACCACCCTCAGATCTACTTATTAAT用干凈的刀片將日的條帶放入0.2 ml EP管中，用吸頭TICAAATATAAATATAATCCTTCTGCCACALCGCACCCAAG搗碎,加入20 μl尤菌蒸餾水，煮沸20 min.離心取4 μl進行TCCCCTGTAGCCCTCTATCGTCCTCCITTCCCTCCG ATTCATTGAGACTTATGGATAACACTATACTACCCAAAA40)山PCR反應(yīng)。系統(tǒng)組成與上述DD-PCR相問。PCR 程序CCTT相應(yīng)的采用兩種、上述方法 1對應(yīng)的再擴增程序為:94C 5min;949 45 s,60C 2 min,72C 1 min.40 個循環(huán);729 103討論min,49.. t述方法2對應(yīng)的再擴增程序為:94C s min;94C30 s,50C 1 min.72C I min,30 個循環(huán);72C 10 min,4C.mRNA卷異顯示從1992年由梁鵬凹建立以來..7 反向-Northem鑒定.克隆、測序在硝酸纖維絮膜(N-Hybond,Pharmacia) 上點樣10 μl .廣泛應(yīng)用于分離和克隆各種體外系統(tǒng)，尋找與細PCR產(chǎn)物。經(jīng)化學變性后正反面紫外交聯(lián),窄溫保存。探針的胞發(fā)育、營養(yǎng)調(diào)控、腫瘤的發(fā)生/轉(zhuǎn)移/診斷.免疫反標記參照HRorhe公司的DIC Labeling Kit 進行,雜交.洗膜和應(yīng)植物遺傳、神經(jīng)科學等有關(guān)的基因方面.是一種顯色均按照Roche 公司的DIC Dxteetion Kit 進行。將雜交確分離術(shù)知基因的快速而有效的方法。它靈敏度高,可認為陽性的片段克隆到pGEM-T" FasyVetor(Promegu)。 堿裂以同時中國煤化工差異.也可同時解法"提取質(zhì)粒。鑒定含目的片段的鹵液送上海博亞公司測分離到. 但是,差異顯示技術(shù)的YH. CNMHG1-直努力尋求解決的問題。經(jīng)過多年的實踐,研究人員不斷優(yōu)化此唐明娟等:muRNA 差外顯示條件的優(yōu)化193技術(shù),包括引物的設(shè)計.PCR參數(shù)、鑒定假陽性、避免的。該方法是將獲得的差異片段結(jié)合到尼龍膜上.分放射性污染等方面。我們經(jīng)過實驗證明,銀染是代替別用對照和處理材料的RNA進行反轉(zhuǎn)錄標記,制備同位索顯示差異條帶的極好方法,它沒有放射污染，成探針。這種方法與Northeni比較起來,只需制備兩其靈敏度與同位索放射白顯影方法相似，可以顯示1個cDNA探針,大大減少了工作量.節(jié)省了經(jīng)費和時Pg水平核酸的變化1810;而且方便、快速,整個銀染只間:本工作在引物、PCR參數(shù)、差顯條帶的顯示方法需要70 min便可知道差異結(jié)果，不需特殊設(shè)備,肉與假陽性的排除等方面均采用上述優(yōu)化方法，獲得限可直接看見空示DNA條帶,可以很h便地從凝膠了較滿意的結(jié)果。上:切下,這是同位素放射自顯影法所無法比擬的。Kammer等人中改進了差異顯示方法,將隨機引參考文獻物從最初的6至10個堿基增長到18個堿基,PCR采川一個低嚴澠的40C退火溫度，后進行60C高嚴1郭順星陳曉梅,于雪梅.金線蓮菌根真菌的分離及其牛物話性研究[1]中國藥學雜志，200.35(7):443謹?shù)耐嘶饻囟?回收差示片段再擴增時全采用高嚴[2] Liang P'eng, Zhu Weimin, Zhang Xiaoying. el a. Dffeentiall謹?shù)耐嘶饻囟取ＵJ為這樣提高s可重復性,降低假陽display using one -hase anchored anligu- dT priners小Nueleie性,沒有出現(xiàn)兩端均為隨機引物的情況,只有一個兩Arids Researth, 1994, 22(25):5763|3] Von der Kanmer H, Albrecht C, Mayhaus M. et oal. ldentifiear端均為錨定引物的片段。然而木研究發(fā)現(xiàn)，按照此tion of genes repulated by musarinir acelylelulime reeplonsap-PCR條件，經(jīng)雜交測序后得到的片段兩端均為隨機plication of an improved and stistically comprechensive mRNA引物。這是因為60C高退火溫度下只有隨機引物能ilerentia display teehnique[J]. Nuclcic Acids Research, 1999,27(10);2211結(jié)合上,錨定引物AT含量太高,熔解溫度低,無法結(jié)[4] 唐明娟。郭順星. 金線蓮RNA提取方法的改進[I]. 中草約。合到模板上。為減少反向-Northern及克隆的工作2002. .33( 10):937量，防止單引物擴增，再擴增時我們采用單引物在[5|薩姆們魯兌 J等.分子克隆實驗指南[MI.北京:科學出版社，1992.1950C做PCR(只用.個隨機引物或錨定引物做引[6]盧檉棟。 現(xiàn)代分f生物學實驗技術(shù)[M].北京:科學出版杜.1991.318物),將單引物能擴出條帶的除掉，剩余的用雙引物[7| liang Peng, Pardee AB. Diferential display of rukaryotie me-才能擴出特異條帶的片段才用于雜交。Genomyx 公senger RNA by means of polymeruse chain reaction[JI. Srience,1992,257:967司發(fā)明了-種HIEROCLYPHTN試劑盒叫,將熒光標[8] Basan BJ, Ciustavo Anles G. Gesho PM. Fiast and senstive記在錨定引物上,而且在3'端錨定引物及5'端隨機silver staining of DNA in polyacrylamidr grls(J]. Anal Biochern.引物序列設(shè)計了特定的'T7啟動子和M13序列,使1991,196:80引物序列上升至31和30堿基，進而i反轉(zhuǎn)錄的溫度[9] Lohnann G, Schickle H. Bosch TCC. REN display.a rapid andefcient method for non -radiuctive diferential display and升到50C,PCR進行4個50C低溫退火循環(huán)后其余mRNA isolation[J| Bio Tech, 1995,18:200全用60C退火。這樣不僅大大提高了特異性,血且只[10] Simon HG, 0ppeneimer s. Advanced mRNA difrential display:isolation of a new diferenial regulated myosin heary chain- en-有結(jié)合了錨定引物的才能被掃描出現(xiàn)，防止r單引coding gene in amhibian limnb regeneration[I. Gene. 1996.172:175物擴增條帶的切取。但是此方法要求昂貴的Geno-川Cenomyx Corpnration. Handbook for HIEIROCLYPHIN mRNAmyxSC掃描和Acquire SC program軟件，限制了熒Profile Kit for Diferenial Display Analysis, for International Us光差顯方法的進一步推廣。[Z|. Coprigh,1997|121 Zhang H. Zhang R, Ling P. Diferentiall screning of grre e反向-Northem是Zhang|等人在1996 首次提出pression diference enriched by difterential diaplay U NucleicAcids Research, 1996, 24(12):2454中國煤化工MYHCNMHG