第40卷第2期應(yīng)用化工VoL 40 No. 22011年2月Applied Chemical IndustryFeb.2011生物法拆分α-苯乙醇李冬桂,馬麗,劉雄民,蔡福寧(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西南寧530004)要:從土壤中篩選出一株能高效選擇性氧化(S)-(-)1苯乙醇的菌株了13,初步鑒定為草酸桿菌( Oxalobacteraceae即p.)。將其用于不對稱氧化拆分消旋a-苯乙醇的反應(yīng)。研究表明,菌株 oralobacteraceae即p.KI3適合的催化拆分條件為:碳源、氮源分別為糊精和蛋白胨發(fā)酵?2h,a苯乙醇質(zhì)量濃度為4g/L反應(yīng)體系初始pH=6,30℃反應(yīng)72h在此條件下,(S)-(-)-1苯乙醇的轉(zhuǎn)化率為9863%,(R)-(+)-1-苯乙醇對映體過量值ee98.01%。關(guān)鍵詞:選擇性催化;a苯乙醇;性拆分中圖分類號:TQ033文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1671-3206(2011)02-0239-04Biological resolution of a-phenyl ethanolLI Dong-gui, MA Li, LIU Xiong-min, CAl Fu-ningSchool of Chemistry Chemical Engineering, Guangui University, Nanning 530004, China)Abstract: The strain JX13 which can catalyze the oxidation of (S)-(-)-l-phenyl ethanol selectively wasscreened from soil. It was identified as Oxalobacteraceae sp. The appropriate conditions for the reactionwere a-phenyl ethanol 4.0 g/L, pH =6.0, 30 C, reaction time 72 h, dextrin as carbon source and pep-tone as nitrogen source The conversion of (S)-(-)-1-phenyl ethanol and the enantiomeric excess of(R)-(+)-I-phenyl ethanol with strain JX13 were up to 98.63% and 98.01%, respectivelyKey words: selective catalysis; a-phenyl ethanol; chiral resolution含芳香基的光學(xué)活性醇是天然產(chǎn)物及手性藥物貴。以微生物整體細(xì)胞代替酶進(jìn)行外消旋芳合成中重要的手性中間體,手性醇的兩個對映體基仲醇的氧化還原拆分,可以利用微生物活性細(xì)胞在手性藥物合成中可用來創(chuàng)造最初的手性中心。生內(nèi)的代謝過程使輔酶再生,免去了添加輔酶及氧化命體系對手性藥物中不同構(gòu)型的立體異構(gòu)體會表現(xiàn)還原酶復(fù)雜且昂貴的分離過程,有利于保持細(xì)胞內(nèi)出不同程度的生理效能23。因此人們更著眼于使氧化還原酶的催化活性。草酸桿菌能參與草酸用高光學(xué)純度的單旋體作為特效藥。代謝主要用于抑制尿結(jié)石的形成1。目前利目前,微生物細(xì)胞催化不對稱還原潛手性酮和用草酸桿菌整體細(xì)胞氧化拆分a苯乙醇的方法尚生物法拆分手性醇是獲得單一對映體手性醇的兩種未見報道重要途徑。利用酯酶或脂肪酶催化外消旋仲醇的對本研究采用了微生物細(xì)胞氧化法拆分a苯乙映選擇性酯化或轉(zhuǎn)酯化拆分及外消旋酯的對映選擇醇篩選出一株能催化選擇性氧化(S)(-)1苯乙性水解拆分是生物法拆分手性醇的一種方式,目醇為苯乙酮的菌株 Oxalobacteraceae s.D13,從而前已有較多文獻(xiàn)報道。但轉(zhuǎn)酯化拆分需先合成得到(R)(+)1苯乙醇,并對拆分反應(yīng)條件進(jìn)行了不對稱酯,伴有副反應(yīng)發(fā)生。利用氧化還原酶催化優(yōu)化研究。的方法將外消旋芳基仲醇的一個對映體氧化為芳基1實驗部分酮同樣可以實現(xiàn)外消旋的芳基仲醇的拆分。這11試劑與儀器過程往往需要輔酶的參與,而這些輔酶非常昂a-苯乙醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%),優(yōu)級純;乙腈收稿日期:2010-1207修改稿日期:010-1214基金項目:廣西應(yīng)用基礎(chǔ)研究專項資助項目(桂科基0832002);廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(桂科攻109012)作者簡介:李冬桂(1985-),女(瑤族),廣西桂林人,廣西大學(xué)在讀碩士研究生師從馬麗高級工程師從事香料化學(xué)方面的研究。電話0771-3270732E-mail:ldg1985@163.cm240應(yīng)用化工第40卷為色譜純;葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、K2HPO4、表1菌株的篩選MSO4·7H2O、FeSO47H2O、NaCl、KH2PO,瓊脂等Tabl1 Microbes screened from so均為分析純;土樣采自南寧高峰林場肉桂種植林區(qū)菌株(S)-(-)-1苯乙醇轉(zhuǎn)化率/%c/995.1893.23土壤。9.22525二元HPLC泵;2487UV/ⅥS檢測器。17221.2培養(yǎng)基1.2.1平板培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20,蛋白胨由表1可知,有4株菌株可將a苯乙醇中的10,酵母膏2.5,K2HPO41.0,MsoO4TH1。O0.5,(s)、(-)1-苯乙醇選擇性氧化為苯乙酮13'菌株FeSO4·7H2O0.01,NaCl0.5,瓊脂20?？梢垣@得較好的轉(zhuǎn)化率和ee值,故選13‘菌株作為1.22斜面培養(yǎng)基(gL)KH2PO,3.0,瓊脂25,實驗菌株。其他試劑與平板培養(yǎng)基相同2.2菌株JX13的鑒定1.2.3富集培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20,蛋白胨l6 S rDNA PCR擴增和序列測定結(jié)果表明菌株10,酵母膏2.5,a苯乙醇0.5mL,K2HPO,L.O,了13為草酸桿菌( Oxalobacteraceae),把該菌株命名MgSO4·7H2O0.5,FesO4·7H2O0.01,NaC10.5。為 Oxalobacteraceae sp.鞏X13。1.2.4初始發(fā)酵培養(yǎng)基除不含α-苯乙醇外,其2.3轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析鑒定他試劑與富集培養(yǎng)基相同。所有培養(yǎng)基均在120℃標(biāo)準(zhǔn)品和轉(zhuǎn)化液HPLC液相分析譜圖見圖1滅菌20min。圖13實驗方法取5g土樣于50mL富集培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)3d。稀釋涂布分離后,30℃培養(yǎng)3d。挑取單一菌落至斜面培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)3d保存于4℃冰箱中備用。挑取斜面培養(yǎng)基上的菌種一環(huán),接種于已滅菌裝有100m發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中,30℃、180r/min培養(yǎng)3d加入0.2ga苯乙醇底物,30℃、180r/min轉(zhuǎn)化3d,得到轉(zhuǎn)化液。分別以底物中(S)-(-)-1-苯乙醇轉(zhuǎn)化率和(R)-(+)-1-苯101112131415161718保留時間/min乙醇的對映體過量值(e)表示反應(yīng)的程度和立體圖1標(biāo)準(zhǔn)樣品HPIC圖選擇性。Fig 1 HPLC chromatogram of standard sample1.4分析方法取轉(zhuǎn)化液1mL于10mL容量瓶中,用流動相定容,將定容后樣品轉(zhuǎn)入干燥離心管中離心8min,取上層清液經(jīng)0.45μm有機系微孔濾膜過濾后,用HPLC分析。HPLC分析條件:色譜柱為配有相應(yīng)預(yù)柱(0.4cmx1cm)的0.46cmx15cm的 Chiralcel O手性柱( Daicel),流動相為v(乙腈):v(水)=1030:70,流速0.5mL/min,紫外檢測波長205mm,進(jìn)保留時間/min樣量10μL。圖2轉(zhuǎn)化液HPLC圖2結(jié)果與討論Fig 2 HPLC chromatogram of sample1.(S)-(-)-苯乙醇;2.(R)-(+)-1-苯乙醇;3.苯乙酮2.1微生物的篩選由圖1、圖2可知,產(chǎn)物的保留時間與苯乙酮標(biāo)對土樣進(jìn)行稀釋涂布在平板上長出一些菌落,準(zhǔn)樣品的保留時間相同,Ⅸ13菌株有選擇性的氧化經(jīng)平板劃線分離得到38株菌株。對38株菌株進(jìn)行(S)-(-)-1-苯乙醇為苯乙酮,留下未反應(yīng)的培養(yǎng)和反應(yīng),篩選結(jié)果見表1。R-(+)-1-苯乙醇,從而實現(xiàn)消旋苯乙醇的拆分。轉(zhuǎn)第2李冬桂等:生物法拆分a苯乙41化反應(yīng)式如下:Oralobacteraceae JX13racemIc-1·PEAR- PEA2.4培養(yǎng)條件對消旋苯乙醇拆分的影響氮源。24.1碳源的影響碳源對微生物的生長起著重2.5反應(yīng)條件對消旋苯乙醇拆分的影響要的作用,在無碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別等質(zhì)量地2.5.1底物加入量影響通常芳香類化合物對活添加葡萄糖、乳糖、糊精、麥芽糖、淀粉、蔗糖碳源培性細(xì)胞具有一定的毒性,圖5為底物質(zhì)量濃度在養(yǎng)3d后,均加人0.2g/L的a苯乙醇底物反應(yīng)16g/L時對a-苯乙醇拆分的影響3d,結(jié)果見圖3120轉(zhuǎn)化率「圈「門「0麥芽糖糊精葡萄糖蔗糖乳糖淀粉a-苯乙醇質(zhì)量濃度/(g·L圖3碳源種類對反應(yīng)的影響圖5a苯乙醇質(zhì)量濃度對反應(yīng)的影響Fig 3 Effects of carbon sources on the reactionFig 5 Effect of p(a-PEA)on the reaction由圖3可知,以糊精、麥芽糖為碳源時。菌體生由圖5可知,底物量在1~3g/L時,底物轉(zhuǎn)化長好,底物的轉(zhuǎn)化率和ee值都很高;以糊精為碳源率和ee值均達(dá)到了100%,當(dāng)?shù)孜锛尤肆繛?時,底物的轉(zhuǎn)化率和ee值達(dá)到了100%。因此,選6g/L時,底物轉(zhuǎn)化率和e值有明顯下降趨勢。因擇糊精作為培養(yǎng)基的適宜碳源此,選取底物加入量為4g/L做其他條件優(yōu)化24.2氦源的影響氮是構(gòu)成菌體成分和合成蛋2.5.2pH對α-苯乙醇拆分的影響pH的改變會白質(zhì)和酶等的重要元素氮源主要分為有機氮源和引起酶活性的變化,過高或過低的pH會改變酶活無機氮源兩類,當(dāng)∝苯乙醇為02g/L時,改變初始性中心的構(gòu)象,造成酶活性的降低。用不同pH的發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源組分,考察等質(zhì)量加入硝酸銨、磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH,考察pH對拆分硫酸銨、蛋白胨、玉米粉、酵母膏氮源對拆分的影響,a苯乙醇的影響結(jié)果見圖6。結(jié)果見圖4?！蹀D(zhuǎn)化率6蛋白胨酵母膏硫酸銨硝酸銨玉米粉圖4氮源種類對反應(yīng)的影響圖6pH對反應(yīng)的影響Fig 6 Efect of pH on the reaction由圖4可知,以蛋白胨和酵母膏為氮源較好,其由圖6可知,pH在5~7時,底物轉(zhuǎn)化率和e中以蛋白胨為氮源時,底物的轉(zhuǎn)化率和e值達(dá)到值變化不大。因此,13·菌種拆分a苯乙醇適宜的了100%。因此,選擇蛋白胨作為培養(yǎng)基的適宜pH范圍是5~7242應(yīng)用化工第40卷25.3溫度對α-苯乙醇拆分的影響反應(yīng)體系的pH=6,30℃反應(yīng)72h,(S)-(-)-1-苯乙醇轉(zhuǎn)化率溫度會影響菌株的催化能力,實驗考察了20~45℃可達(dá)98.63%,ee值達(dá)98.01%,實現(xiàn)了菌株范圍內(nèi),反應(yīng)溫度對拆分反應(yīng)的影響結(jié)果見圖7。 Oxalobacteraceae sp.JK13對a苯乙醇的最佳拆分效參考文獻(xiàn):R, Paulo J S moraadvances in the biocatalytic asymmetric reduction of ace-tophenones and a, B-unsaturated carbonyl compouds[J]Food Technol Biotechnol, 2004, 42(4): 295-303[2]宮麗,卞俊手性藥物的藥理學(xué)立體選擇性[打]國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊,2007,34(2):123-126.溫度饣[3]王丹,李亞手性藥物及其開發(fā)與應(yīng)用[J現(xiàn)代醫(yī)藥圖7溫度的影響衛(wèi)生,2007,23(6):837838.Fig 7 Effect of temperature on the reaction[4]王普善王宇梅手性藥物開發(fā)戰(zhàn)略的再認(rèn)識[刀]精由圖7可知,在30℃時,轉(zhuǎn)化率和ee值為最細(xì)與專用化學(xué)品,2004,12(10):48高,隨著溫度繼續(xù)升高,轉(zhuǎn)化率和e值均下降,[5]張中義,吳新俠脂肪酶在手性藥物制備中的應(yīng)l40℃時,基本無轉(zhuǎn)化。這主要是因為溫度過高,部[J].食品與藥品,2007,9:4043.[6]嚴(yán)祥輝,薛屏.用殼聚糖修飾的MCM48固定化脂肪分氧化還原酶已失活。因此,選擇30℃為適宜的轉(zhuǎn)酶拆分(R,S)-1-苯乙醇[J].寧夏大學(xué)學(xué)報,2009,30化溫度。(1):50542.5.4反應(yīng)進(jìn)程曲線在上述最優(yōu)條件下,考察了[7]王晨王文凱陳華勇脂肪酶催化拆分1(4甲氧基1~5d菌株 Oxalobacteraceae sp.X13拆分α苯乙醇苯基)乙醇的研究[冂]現(xiàn)代食品科技,200,25(4)的反應(yīng)進(jìn)程,見圖8。[8]王旭徐威游松微生物轉(zhuǎn)化在藥學(xué)中的應(yīng)用[門]沈陽藥科大學(xué)學(xué)報2006(23)7:4774829] Nie Y, Xu Y, Mu X Q.of racemic 1-phenyl-1, 2-ethanediol by stereoinmversion in-ing a novel cofactor-dependent oxidoreduction systemof candida parapsilosis CCTCC M203011[J]. Org ProcessRes Dev,2004,8:246-251[10]Nakamura K, Fujii M, Ida Y Stereoinversion of arylethB-ols by Geotrichum candidum[J]. Tetrahedron asymme080100120140ty,2001,12:3147-3153[11]張玉彬生物催化的手性合成[M].北京:化學(xué)工業(yè)出圖8反應(yīng)時間的影響版社,2003由圖8可知轉(zhuǎn)化開始階段隨著時間的增加,[12]曾棘楊忠華姚善涇生物催化不對稱還原合成手性Fig 8 Eifect of time on the reaction醇的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2004,23(11):轉(zhuǎn)化率和ee值都增大,72h左右達(dá)到最大值;之后,1169-1173.ee值變化不大。故選取最佳的轉(zhuǎn)化時間為72h[13] Abratt V R, Reid S J. Oxalate-degrading bacteria of the3結(jié)論human gut aB probiotics in the management of kidneystone disease [J]. Advances in Applied Microbiology(1)篩選到一株具有高選擇性氧化(S)-(-)2010,72:63871苯乙醇的菌株 Oxalobacteraceae即.13,實現(xiàn)了[14] Milliner D. Treatment of the primary hyperoxaluria:Aα-苯乙醇的氧化拆分。用HPLC對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分new chapter[ J]. Kidney Int, 2006, 70(7): 1198-2000.析,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為苯乙酮。[15]楊忠華姚善涇,王光輝引入樹脂吸附促進(jìn)酵母細(xì)胞(2)最佳培養(yǎng)條件以糊精和蛋白胨為碳源、氮不對稱還原芳香酬[J].化工學(xué)報2006,57(10):2388源,a-苯乙醇質(zhì)量濃度為4g/L,反應(yīng)體系初始2392