第22卷第4期分析測試學(xué)報Vol, 22 No 42003年7月FENXI CESHI XUEBAO(Jourmal of Instrumental An乙醇含量的酶法測定柳暢先,陳勇(中南民族大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,湖北武漢430074)摘要:利用醇脫氬酶(ADH)催化乙醇與氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NA應(yīng)的原理,通過測定還原型煙酰胺腺嘌呤〓核苷酸NADH馺光度的變化率得岀其酶促反應(yīng)速度,對應(yīng)不同的乙醇含量而制得標(biāo)準(zhǔn)曲線試樣中乙醇含量由測定值査標(biāo)準(zhǔn)曲線求得;討論了pH值和抑制劑對測定的影響;方法簡便、快速、準(zhǔn)確。關(guān)鍵詞:乙醇;酶催化法;醇脫氫酶中圖分類號:0657.32;0623.411文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1004-4957(2003)04-0096-02乙醇含量的測定方法通常有比重瓶法、氣相色譜法、伏安法等,近年來酶法在分析測定方面得到廣泛應(yīng)用,以酶法測定乙醇含量已有報道本研究基于醇脫氫酶催化乙醇反應(yīng):CHOH+NADCH&CHO+NADH,通過測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH馺光度的變化率得岀其酶促反應(yīng)速度,對應(yīng)不同乙醇含量制得標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而可測定試樣中的乙醇含量。由于酶促反應(yīng)的專一性,可避免試樣中眾多共存組分的干擾,減少繁雜的預(yù)處理過程。作者應(yīng)用酶促反應(yīng)速度測定法,不需要底物轉(zhuǎn)變完全,可減少測定時間,節(jié)省酶的用量,并獲得較高靈敏度。1實驗部分1.1儀器與試劑UV-9100型分光光度計(深圳愛克分析儀器有限公司),光學(xué)讀數(shù)分析天平(湘儀天平儀器廠pHs-3C型精密酸度計(上海雷磁儀器廠),WH-l型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,醇脫氬釀ADH),0.α5molL氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NA),0.05molL三羥甲基氨基甲烷Tris),0.2mol/L乙二胺四乙酸二鈉EDTA1.2實驗方法于石英比色皿中加入3m0.05mol/ L Tris-HCl緩沖液,40μL1.7mol/L乙醇標(biāo)準(zhǔn)液,以及40L0.05mol/LNAD溶液后混勻,再加入10μLAD溶液,快速混勻后立即在所選定的波長處測定吸光度變化值△A(每隔15s測定一次吸光度值,共10次)。計算酶促反應(yīng)速度t1=△A×V/(△t×E×b)式中,v為酶促反應(yīng)速度(mol/min):△A為吸光度變化值;v為反應(yīng)液體積(mL);Δt為時間變化值(min);e為摩爾吸收系數(shù)(L/mmol·cm);b為比色皿寬度(cm)。根據(jù)米氏方程由酶促反應(yīng)速度可求出乙醇濃度:1/v=Kn/(tmc)+1/ma。式中,K為米氏常(mol/);thm為最大酶促反應(yīng)速度(mol/min);c為乙醇濃度(mol/L)。2結(jié)果與討論2.1NADH吸收光譜本法是通過NADH吸光度的變化率測定反應(yīng)速度,因此需進(jìn)行NADH吸收波長實驗,在無其它雜質(zhì)吸收峰干擾旳情況下,可選擇最大吸收波長,本實驗選擇340mm作為測定波長22pH值的影響反應(yīng)溶液的pH值不但影響酶的穩(wěn)定性,還影響酶活中國煤化工離狀態(tài),酶-底物復(fù)合物以及底物的解離狀態(tài),從而影響酶促反應(yīng)速度。CNMHG·12.范圍內(nèi)研究了pH值對酶促反應(yīng)速度的影響。由圖1可知,最佳pa什H要收稿日期:2002-修回日期:2003-05-12基金項目:國家民族委員會自然科學(xué)基金資助項目作者簡介:柳暢先(1956-),女,湖北武漢人,副教授柳暢先等:乙醇含量的酶法測定2.3共存組分的影響試驗了其它醇類如甲醇、異丙醇、正丁醇、乙二醇、丙三醇與NAD的反應(yīng),發(fā)現(xiàn)正丁醇在ADH的作用下與NAD也發(fā)生反冒應(yīng),但反應(yīng)速度與乙醇相比要小得多。另外,由于本研究所用的酶法是酶促反應(yīng)速度的測定,如果試樣中某些共存組分為激活劑或抑制劑,它們將可能改變反應(yīng)速度而干擾測定。而金屬離子易與酶活性部位中的基團(tuán)作用,因此試驗了常見金屬離子MHg對測定的影響,未見有激活作用。試驗發(fā)現(xiàn)zn2+、C圖1pH值的影響Hg2對酶促反應(yīng)速度有抑制作用。由圖2可見,隨著抑制劑加入Fig 1 Effect of pH on speed過加入ETA與抑制劑絡(luò)合可部分消除其影響。對2.5mmoL4 nematic reaction量增多,對酶活性的抑制作用逐漸加強(qiáng),反應(yīng)速度逐漸下降。通的乙醇進(jìn)行干擾試驗,存在5 mmoL/L edta,相對誤差在±5%之內(nèi)時,干擾組分的允許量(mol/L)為:Zm2+1700c+30oHg0.32.4標(biāo)準(zhǔn)曲線按實驗方法測出系列乙醇標(biāo)準(zhǔn)液的酶促反應(yīng)速度,由于反應(yīng)速度只是在底物濃度很低時,才與之成正比,當(dāng)?shù)孜餄舛仍龈?0c(Cd- L時,υ-c(CHOH)線逐漸彎曲,而根據(jù)米氏方程,1/-1/cc(zn2yumol-L)c(HgXnmol-L-)(CH5OH)為直線關(guān)系,因此用雙倒數(shù)作圖法所繪1/-1/c(CHOH)曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性范圍較寬。c(CHOH)在圖2抑制劑的影響Fig. 2 Effect of inhibit0.5~20mmoL范圍內(nèi)與υ呈直線關(guān)系。其回歸方程為1/=0.2113/c+0.0159,r=0.997。2.5血清乙醇含量的測定及回收試驗按實驗方法測定了小牛血清中的乙醇含量,并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,結(jié)果見表1。表1試樣測定及加標(biāo)回收試驗結(jié)果(n=5)Table 1 Determination results of ethanol in samples and recovery for added standard (n =5Addeda/(mgL-1)97,8755.50104,1636.193參考文獻(xiàn)[1 ATWATER JE, AKSE JR, DEHART J, et al. Enzymatic determination of ethanol using" electrocatalyzed lu-minol chemiluminescence]. Anal Lett, 1997, 30(8): 1445-1453[2] CASTANON M J L, ORDIERES A J M, BLANCO P T. Amperometric detection of ethanol with poly-(o-phenylenediaminemodified enzyme electrodesLJI. Biosens Bioelectron, 1997, 12(6): 511-5203 PANDEY P C, UPADHYAY S, UPADHYAY BC, et al. Ethanol biosensors and electrochemical oxidation of NADH[J].AnalBiochem,1998,260(2):195-203Enzymatic Determinatin凵中國煤化工CNMHGLIU Chang-xian, CHEIvCollege of Chemistry and Life Science, South-central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)n enzymatic method was applied to determine ethanol based on the reaction of ethanol and nicoti第22卷第4期分析測試學(xué)報Vol, 22 No 42003年7月FENXI CESHI XUEBAO(Joumal of Instrumental analysi用混合粘合劑修飾的碳糊電極測定諾氟沙星朱明芳,宋粉云',毋福海2,曾勇勝3,曾常青,黃慶華1,廖月鏡1(1.廣東藥學(xué)院藥學(xué)系,廣東廣州510224;2.廣東藥學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系,廣東廣州510243.廣東省陽西縣衛(wèi)生防疫站檢驗科,廣東陽西529500)摘要:在p10.50的磷酸鹽緩沖溶液中,當(dāng)含有0.8 mmol/L.的NHCl,8mgL的SIS(十二烷基磺酸鈉)時諾氟沙星在由69.1%w舶的石墨粉、24.5%的液體石蠟和6.4%(ν舶甘油組成的混合粘合劑碳糊電極上產(chǎn)生一靈敏的陰極溶岀還原峰,峰電位為-1.61Ⅴ;峰電流與諾氟沙星濃度在8.0×10-°-4.0×10-~molL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為r=0.9949,檢岀限為3.0×10-°molL;該法用于測定諾氟沙星膠囊含量,結(jié)果令人滿意關(guān)鍵詞:諾氟沙星;碳糊電極;伏安法中圖分類號:0657.15;R978.19文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1004-495720034-0098-0諾氟沙星( norfloxacin,N)又名氟哌酸,屬于第三代喹諾酮類抗菌藥物。由于本品具有抗菌譜副作用小以及與其它藥物交叉耐藥性較少等特點,廣泛用于臨床。其測定方法有非水滴定法、紫外分光光度法2、熒光分光光度法3、極譜法μ4、色譜法-η等。用碳糊電極測定諾氟沙星未見報道。作者研究諾氟沙星在混合粘合劑碳糊電極上的伏安行為1實驗部分1.1儀器與試劑肥P3-1型示波極譜儀(山東電訊七廠),三電極系統(tǒng),自制碳糊電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑電極為對電極;821型袖珍數(shù)字式pH酸度試中山大學(xué)電子廠諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0mol/):準(zhǔn)確稱取0.0639g諾氟沙星原料藥純度為99.3%,由廣州市僑光制藥廠提供),用2mL0.lmol/LHC溶解,稀釋至100m,貯于棕色容量瓶中保存;SIs十二烷基磺酸鈉諮液(1.0gL):稱取0.10gS孓分析純),用水溶解并稀釋至10mL;石墨粉光譜純,上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠);液體石蠟(分析純,廣東汕頭新寧化工廠);甘油分析純,廣州化學(xué)試劑廠)其它試劑均為分析純,溶液按常規(guī)方法配制,實驗用水為二次蒸餾水。1.2液體石蠟一甘油混合粘合劑碳糊電極的制備1.30g石墨粉、0.46g液體石蠟、0.12g甘油混合攪拌均勻后,填入內(nèi)徑為4.0mm,長為50mm的玻管中,用玻棒壓緊,插入銀絲作導(dǎo)線,在光滑的紙上拋光,備用。1.3實驗方法取1.8mLpH10.50的磷酸鹽緩沖溶液、0.4mL0.02mol/LNC和0.4m0.2g/SS溶液混合,加入適量的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液,混合均勻,稀釋至10mL,用液體石蠟-甘油混合粘合劑碳糊電極作工作電極,在-0.70處靜止富集90s,記錄陰極溶岀伏安曲線,測量-1.61V處的導(dǎo)數(shù)波高其中掃描范圍為-0.70~-1.99V,掃速400mV/s收稿日期:2002-09-07;修回日期:2003-05-14作者簡介:朱明荒(1970-),女,湖南邵陽人,講師,碩士amide adenine dinucleotide in oxidized form(Nad)catalyzed by alcohol dehvdrogenase( ADH). The change rateof the absorbance of nicotinamide adenine dinucleotide in red中國煤化工 I to obtain thvelocity of the enzymatic reaction and the calibration curveC N M HGhanol in samples wasdetermined by the calibration curve. The effect of the pH and the inhibitor was discussed. The method is simpleKey words: Ethanol; Enzymatic method; Alcohol dehydrogenase