第23卷第4期農(nóng)業(yè)工程學報2007年4月Transactions of the CSAEApr.2007苧麻纖維質(zhì)酶降解生產(chǎn)生物燃料乙醇的工藝彭源德,鄭科,楊喜愛,嚴理,唐守偉,朱愛國,熊和平(中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所,長沙410205)摘要:在微生物預處理蘭麻韌皮的基礎(chǔ)上,進行了pH值、酶用量、葡萄糖濃度和原料處理方式等對苧麻纖維質(zhì)酶降解的單因子試驗和正交試驗。結(jié)果表明,苧麻纖維質(zhì)酶解的起始pH值為50左右,總糖轉(zhuǎn)化率最高,達72.361%在一定的酶濃度范圍內(nèi),隨著酶量的增加,苧麻纖維質(zhì)的總糖轉(zhuǎn)化率提高,酶的適宜用量為:木聚糖酶5%纖維素酶10%水解液中葡萄糖濃度在0.5%以下時,苧麻纖維質(zhì)的總糖轉(zhuǎn)化率不受影響,葡萄糖濃度在05%以上時,隨著水解液中葡萄糖含量的增加,總糖轉(zhuǎn)化率下降;些麻纖維質(zhì)酶解過程中,對原料進行機械處理有利于提高酶的水解效率;蘭麻纖維質(zhì)酶解的最適條件為;pH值4.5~5.5、纖維素酶濃度8%~11%葡萄糖濃度小于0.5%、原料不洗直接進行剪碎處理關(guān)鍵詞:苧麻;纖維質(zhì);酶降解;影響因素中圖分類號:S216.2文獻標識碼:A文章編號:1002-6819(2007)4-0006-05彭源德,鄭科楊喜愛,等.苧麻纖維質(zhì)酶降解生產(chǎn)生物燃料乙醇的工藝[]農(nóng)業(yè)工程學報,2007,23(4):6-10.Peng Yuande, Zheng Ke, Yang Xi'ai, et al. Technology for producing bio-ethanol from ramie lignoellulosic degradationwith enzymes[]. Transactions of the CSAE, 2007, 23(4): 6-10. (in Chinese with English abstract)解得糖率為45,3%~54.5%,全纖維素轉(zhuǎn)化率平均為0引言73.8%;沈金龍等(2004)利用纖維素酶高產(chǎn)菌株里氏木隨著化石燃料等不可再生資源的逐步消耗殆盡,開霉突變株813A所產(chǎn)生的纖維素酶,對天然木質(zhì)纖維素發(fā)利用可替代能源為當務之急。近年來,國內(nèi)外學者廣的水解糖化過程進行了研究,玉米葉和楊樹葉的水解糖泛開展了植物纖維質(zhì)如玉米秸稈、甘蔗渣、檸檬酸渣酒化率分別達到86.12%和56.10%酒精轉(zhuǎn)化率79.14%糟、稻殼等通過生物轉(zhuǎn)化得到燃料乙醇的研究-1,以~72.11%。但由于受硫酸預處理的環(huán)境污染嚴重,植物纖維質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是將纖維素酶的活力不高技術(shù)不完善等因素的影響導致纖維質(zhì)和半纖維素水解為單糖,即糖化過程,而酶糖化技術(shù)是生產(chǎn)燃料乙醇的產(chǎn)業(yè)化進程緩慢作者采用微生物預處被普遍看好的糖化工藝。例如加拿大的 logen公司,利理和酶降解糖化技術(shù),將苧麻纖維質(zhì)酶降解生產(chǎn)燃料乙用從遺傳工程真菌所制成的纖維素酶有效地使纖維素醇取得重要進展。前文報道了外界因子對纖維質(zhì)酶水解為葡萄糖和其它糖類1。 Zoned等(1991)利用純降解的影響。本研究擬在此基礎(chǔ)上,通過研究起始pH化的葡萄糖苷酶和纖維素酶同時酶化纖維素,大大提值、酶和葡萄糖濃度及原料物理處理方式等主要因素對髙了糖化速率ω;Hari等(2000利用模式菌種里氏木苧麻纖維質(zhì)酶降解的影響,優(yōu)化酶降解的條件,確定苧霉( Trichoderma reesei)QM-9414產(chǎn)生的纖維素酶對麻纖維質(zhì)酶解糖化的工藝流程和技術(shù)參數(shù),為加速研究香蕉葉子進行降解,獲得了較高的糖化率。國內(nèi),木苧麻木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料酒精酶糖化技術(shù)改良酶促反質(zhì)纖維素等生物酶降解生產(chǎn)燃料乙醇的研究剛剛起步。應條件(如除去某些酶解產(chǎn)物降低酶促反應平衡點)研張發(fā)群等(1991)糖化蔗髓時,先用CaO處理,再經(jīng)究等方面提供科學依據(jù),進而充分挖掘中國特有的苧麻Trichoderma Uoningji P2菌株所產(chǎn)生的酶液進行分纖維質(zhì)資源,緩解能源緊張的矛盾,達到保護生態(tài)環(huán)境的目的。基金項目國家948項目(206-618)中國農(nóng)業(yè)科學院科技經(jīng)費課1材料與方法題和湖南省麻類作物遺傳育種與麻產(chǎn)品生物加工重點實驗室課題“苧麻生產(chǎn)燃料酒精的酶糖化技術(shù)基礎(chǔ)研究”的部分研究內(nèi)容1.1材料作者簡介:彭源德(1965-),男,研究員,主要從事農(nóng)產(chǎn)品生物加工研究。長沙中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所410205 Email: ibepyd313中國煤化工與環(huán)保研究室選育并蛋通訊作者,和平,研究員,博士生導師,研究方向為麻類酶加工保藏CNMHG研究。長沙中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研充所410205, Email: Ramiexhp2)纖維素酶和木聚糖酶@2118由湖南尤特爾生化有限公司提供的液體纖維素酶第4期彭源德等:苧麻纖維質(zhì)酶降解生產(chǎn)生物燃料乙醇的工藝和木聚糖酶,其活性分別為2000IU/mL和6000種處理方式,進行苧麻纖維酶水解糖化。IU/mL左右3)正交試驗3)主要儀器與設(shè)備在苧麻纖維質(zhì)酶水解糖化過程中,對起始pH值、分析天平、精密pH計磁力加熱攪拌器、分光光度酶和葡萄糖濃度及原料物理處理方式等4個因素,進行計、搖瓶機、生化培養(yǎng)箱、高速組織搗碎機、電熱恒溫水3個水平的正交試驗。以確定影響苧麻纖維質(zhì)酶水解糖浴鍋、計時器、移液器和微量進樣器等?；淖畲笠蛩?找出最佳工藝條件。正交設(shè)計表中水平4)化學試劑與因子L(34)各因素的取值范圍見表1,按L(34)安排試驗涉及的主要化學試劑有:CMC( sigma的試驗計劃見表2c-5678)、木聚糖、聚半乳糖醛酸、無水葡萄糖、檸檬酸表1正交試驗因素水平設(shè)計L,(34)磷酸氫二鈉緩沖溶液、氫氧化鈉溶液、鹽酸、硫酸、3,5-Table 1 Factors and levels of orthogonal test L,(3)二硝基水揚酸、酒石酸鉀鈉、高錳酸鉀和草酸鈉等,工藝水平輔料主要包括菌種活化、擴大培養(yǎng)和發(fā)酵的培養(yǎng)基組分等,這些物質(zhì)均為市售商品。纖維素酶濃度/%111.2方法葡萄糖濃度/%原料處理方式不洗剪碎洗凈不剪1)預處理用Ym68菌株對苧麻韌皮進行預處理,即利用微表2試驗計劃表生物酶催化,分、降解生苧麻中的非纖維素物質(zhì)準確稱Table 2 Design of test arrangement取苧麻韌皮10.0000g,按20%(對苧麻韌皮)的接種量,將培養(yǎng)5~6h的高效菌株Ym68°接種到生苧麻試驗號pH值纖維素酶濃度葡萄糖濃度/%原料處理方式上;在35C左右條件下,靜置濕潤發(fā)酵6~8h,洗凈備1231(4.5)1(4.5)2(0.5)2(不洗剪碎)用1(4.5)3(11)3(5)3(洗凈不剪)2)單因子試驗2(0.5)3(洗凈不剪)采用500mL錐形瓶盛微生物預處理后的苧麻纖2(81(不洗)維質(zhì)10g左右,混合酶水解時,木聚糖酶用量5%纖維素酶用量10%(以酶液對苧麻纖維的質(zhì)量%表示),浴5678(5.5)3(11)1(0)2(不洗剪碎)1(5)3(5)2(不洗剪碎)3(6.5)1()3(洗凈不剪)比1:10,pH值5.5,置50℃恒溫處理5h;纖維素酶水3(6.5)3(11)2(0.5)1(不洗)解時,酶用量為10%(以酶液對苧麻纖維的質(zhì)量%表示),浴比1:15,pH值4.5,置50℃恒溫處理6h;3次4)測定方法重復,測定處理前、后液體中的還原糖量。還原糖的測定采用DNS比色定糖法(540nm);pH根據(jù)研究目的設(shè)置pH值溫度、原料處理方式、值用PHS3C型酸度計測定;酸性纖維素酶活性測定采葡萄糖濃度等對苧麻纖維質(zhì)酶降解糖化的影響試驗。用CMC法;木聚糖酶的酶活測定采用DNS法,底物為1)纖維質(zhì)糖化的起始pH值試驗:分別設(shè)置pH值 sigma公司生產(chǎn)的木聚糖。為45、5.05.5、6.06.5和7.0,進行苧麻纖維質(zhì)的混2結(jié)果與分析合酶(纖維素酶和木聚糖酶)和纖維素酶的水解糖化,測定水解液前后的還原糖量。2.1起始pH值對纖維質(zhì)水解糖化的影響2)酶的用量試驗:木聚糖酶用量分別為2%5%pH值對纖維質(zhì)水解糖化的影響結(jié)果列于表3,從和8%,纖維素酶量分別為5%10%和15%單一纖維表3可以看出,pH值在4.5~6.5之間時,苧麻纖維質(zhì)素酶用量均為10%,進行苧麻纖維質(zhì)的混合酶(纖維素的糖化率沒有極顯著差異,以pH值5.0的糖化率最酶和木聚糖酶)和纖維素酶的水解糖化,測定水解液前高,酶活性最大;在pH7.0時,糖化率極顯著降低。因后的還原糖量。此,可以得出,5.0是苧麻纖維質(zhì)酶水解糖化的最適pH3)葡萄糖濃度試驗:在苧麻纖維質(zhì)水解糖化時,分值,總糖轉(zhuǎn)化率為?361%別加入0.5%、2%、5%和8%的葡萄糖、以未添加葡萄2.2中國煤化工糖的為對照,測定起始和終點的還原糖量。CNMHG度范圍內(nèi),隨著酶量4)原料處理方式:設(shè)置微生物預處理后的苧麻纖的增加,酶的水解效率提高。木聚糖酶由2%增加到維質(zhì)直接酶水解、剪碎成0.5cm、搗碎和風干剪碎等四5%纖維素酶從5%提高到10%糖化率提高近9個百農(nóng)業(yè)工程學報2007年分點,有極顯著差異;但木聚糖酶和纖維素酶的酶量再高,達72.622%;其次是剪碎處理的;再次為濕潤纖維分別增加到8%和15%時,糖轉(zhuǎn)化率幾乎沒有差異。這質(zhì)直接水解糖化的,糖化率為62.066%;風于剪碎處理是由于在一定條件下,一定量的半纖維素和纖維素分子的糖化率最低僅為32.003%這可能是由于酶吸附于能和酶分子結(jié)合的結(jié)合點數(shù)有限,當這些結(jié)合點全被酶纖維素表面是纖維素發(fā)生水解的必需條件,機械處理使分子占據(jù)后,酶分子處于飽和態(tài),再增加酶用量,也起不纖維素的比表面積增加,有利于纖維素酶的吸附,進而到酶解作用因此,從經(jīng)濟角度考慮,酶用量以木聚糖酶提高酶的水解效率95%和纖維素酶10%比較適宜。表6原料物理處理方式與總糖轉(zhuǎn)化率的關(guān)系表3pH值對苧麻纖維質(zhì)水解總糖量的影響Table 6 Relationship between methods of materialTable 3 Effects of pH value on ramie lignocellulosictreatment and the rate of saccarification /degrading with enzymes原料處理方式不處理剪碎搗碎風干剪碎60.64568.86171.20929.181重復I6.42327.1586.70915.96765.66155.4473重復160.07158.3174.03534.274重復I6.9847.31646,84566.18645.95145.4571重復5,48261.71572.832555平均6.70367.23616.77746.0775.80655.45222.06662.96272.62232.0030. 05 abeda=0.0515.31(<0.0023)F值9,88(<0.0001表4酶用量對總糖轉(zhuǎn)化率的影響2.5正交試驗Table 4 Effects of enzymes concentration on ramie從pH值、纖維素酶和葡萄糖濃度及原料處理方式gnocellulosic saccharification等因素的正交試驗結(jié)果表7可以看出,4種因素對苧麻酶用量2、CX-5、C-10X-8,C-15纖維質(zhì)酶降解的糖化率均有影響,以葡萄糖濃度的極差重復I66.72257.985最大,為16.54%;其次是原料處理方式,為12.28%;再重復56.42664.343次為起始pH值,極差8.61%;纖維素酶濃度的極差最重復■小,僅為8.59%。也就是說,苧麻纖維質(zhì)酶降解中的葡53.68462.343萄糖濃度對總糖轉(zhuǎn)化率的影響最大,原料處理方式次之,纖維素酶濃度的影響最小。從表7還可以看出,正交F值7.87(<0.0211)試驗中,各因子對苧麻纖維質(zhì)酶降解的糖化影響效果注XC分別表示木聚糖酶和纖維素,X-2C-5分別表小2%的木單因子試驗的基本一致,其酶降解的適宜條件為:pH聚糖和5%的纖維素,如此類推。值4.5~5.5、纖維素酶濃度8%~11%葡萄糖濃度小2.3葡萄糖濃度的影響于0.5%、原料進行不洗剪碎處理。葡萄糖含量對纖維素降解的影響如表5所示,水解表7苧麻纖維質(zhì)酶水解過程中主要影響因素液中葡萄糖濃度在0.5%以下時,苧麻纖維質(zhì)的總糖轉(zhuǎn)的正交試驗結(jié)果化率不受影響;葡萄糖濃度在0.5%以上時,隨著水解Table 7 Results of orthogonal test on major influence factorsduring ramie enzymatic lignocellulosic degrading液中葡萄糖含量的增加,總糖轉(zhuǎn)化率下降;當葡萄糖濃實驗H纖維素酶葡萄糖濃度原料處理糖化率度為8%總糖轉(zhuǎn)化率下降了64%左右。濃度/%表5萄糖(G)含量對纖維素降解的影響1(0)Table 5 Effects of glucose concentration on ramie21(4.5)2(8)2(0.5)2(不洗剪碎)60.83(4.5)3(11)3(5)3(洗不剪)37.84lignocellulosic saccharification(5.5)1(5)2(0.5)3(洗不剪)42.3G濃度/%5.5)3(5)1(不洗)30.25總糖轉(zhuǎn)化率/%67.4968.61576538.1224.332(5.5)3(11)1(0)2(不洗剪碎)62.39(5)3(5)2(不洗剪碎)32.923(6.5)l(0)3(洗不剪)39.162.4原料處理方式3(112(0.51(不洗)苧麻纖維質(zhì)不同處理方式的酶水解糖化效果列于中國煤化工4.5表6,表6結(jié)果表明,生物脫膠后的苧麻纖維質(zhì)處理方CNMHG39.77式對酶水解糖化有明顯的影響,機械處理可加速纖維質(zhì)8.61酶水解糖化進程,糖化率提高。以搗碎處理的糖化率最第4期彭源德等:苧麻纖維質(zhì)酶降解生產(chǎn)生物燃料乙醇的工藝3結(jié)論與討論中南民族學院學報(自然科學版),1995,14(1):36-3[5]李盛賢,賈樹彪顧立文.利用纖維素原料生產(chǎn)燃料酒精的在微生物預處理苧麻韌皮的基礎(chǔ)上,在實驗室條件研究進展[].釀酒,200532(2):13-16.下進行pH值酶用量、葡萄糖濃度和原料處理方式等6]李穩(wěn)宏吳大雄,高新,等麥秸纖維素酶解法產(chǎn)糖預處對苧麻纖維質(zhì)酶降解的單因子試驗和正交試驗,可以得理過程工藝條件[].西北大學學報(自然科學版),1997出如下結(jié)論:1)蘭麻纖維質(zhì)酶解的起始pH值為50左27(3);227-230右,總糖轉(zhuǎn)化率最高達72.361%。2)在一定酶濃度范7宋安東,張建酸,吳云漢利用酒槽生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙圍內(nèi),隨著酶量的增加,苧麻纖維質(zhì)的總糖轉(zhuǎn)化率提高,醇的實驗研究[].農(nóng)業(yè)工程學報,2003,19(4):278-281.酶的適宜用量為:木聚糖酶5%、纖維素酶10%。3)水[8]許風,孫潤倉,詹懷宇,木質(zhì)纖維原料生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇解液中葡萄糖濃度在0.5%以下時,芝麻纖維質(zhì)的總糖的研究進展[J].纖維素科學與技術(shù)轉(zhuǎn)化率不受影響;葡萄糖濃度在0.5%以上時,隨著水〔9]楊斌呂燕萍高孔榮等蔗渣水解液發(fā)酵乙醇的研究[].生物工程學報,1997,13(4):380-386.解液中葡萄糖含量的增加,總糖轉(zhuǎn)化率下降。4)苧麻纖[10張建安,張小勇韓潤林等木素對纖維素酶解的影響及維質(zhì)酶解過程中,對原料進行機械處理,有利于提高酶纖維素酶解[].化學工程,200028(1)137-39,43.的水解效率。5)苧麻纖維質(zhì)酶解的最適條件為PH值[1]劉家健,陸怡,預處理對纖維素酶降解影響的研究U4.5~5.5、纖維素酶濃度8%~11%葡萄糖濃度小于林產(chǎn)化學與工業(yè),199515(3):67-710.5%、原料不洗直接進行剪碎處理。[12]劉超綱.分批添纖維素酶水解研究[]林產(chǎn)化學與工業(yè),苧麻具有生物學產(chǎn)量和纖維素含量高、木質(zhì)素含量1996,16(1):58-61低等特點,是生產(chǎn)燃料乙醇的理想原料之一。本文通過[13] Katharine Sanderson. US biofuels: A field in fermentI高效清潔的預處理(6~8h完成生物發(fā)酵)和適宜的酶Nature,2006:673-676促反應條件研究獲得了較高的糖化率(72%),為苧麻[14]綜述秸桿酒精產(chǎn)業(yè)[DBOL].htp://log. bioon.cn/纖維質(zhì)酶降解生產(chǎn)燃料乙醇技術(shù)提供了依據(jù)。同時,根user1/465/archives/ 2005/25847. shtml據(jù)本研究中纖維素酶和木聚糖酶的用量,估算出每噸燃[15]黃祖新陳由強陳如凱.甘蔗渣的酶降解研兗進展[]甘料乙醇所需酶的成本在2000元左右。這與前人研究的蔗,2004,11(4):52-56.酶解成本約占總純生產(chǎn)成本的40%~55%結(jié)論基本[16] Krishna S H, Sekhar R, Suresh B,etal. Studies on the一致。通過提高酶的活性,減少酶的用量;優(yōu)化酶解條production and application of cellulase from Trichoderma件,提高酶的效率是降低苧麻纖維質(zhì)酶降解生產(chǎn)燃料乙reesei QM-9414DJ. Bioprocess Engineering, 2000,22:467醇成本的關(guān)鍵。470[17]沈金龍,毛愛軍,王遠亮,等.纖維素酶在木質(zhì)纖維素生物[參考文獻]質(zhì)轉(zhuǎn)化中的應用研究[]微生物學報,2004,44(4),507[1]鄧良偉.纖維素類物質(zhì)生產(chǎn)燃料酒精研究進展[.食品與發(fā)酵工業(yè),1995,21(5):69-72.[18]彭源德鄭科,楊喜愛,等._麻纖維質(zhì)酶降解生產(chǎn)燃料[2]段鋼,孫長平.酶在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料酒精中的應用乙醇技術(shù)研究-1[].中國麻業(yè),2006,(4[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,(5)[19] Sinitsyn A P, Gusakov A V, Vlasenko E Y. Effect of[3]傅其軍燃料酒精的發(fā)展前景[J]廣西輕工業(yè),2001,(2)structural and physicochemical features of cellulosicthe efficiency of enzyhydrolysis[J][4]李步海,孫小梅郝文穎.酶解蔗渣蒸汽預處理研究[]Appl Biochem Biotechnol, 1991, 30:43-59.中國煤化工CNMHG10農(nóng)業(yè)工程學報2007年Technology for producing bio-ethanol from ramie lignocellulosicdegradation with enzymesPeng Yuande, Zheng Ke, Yang Xiai, Yan Li, Tang ShouChangsha, Hunan 410205, China)Abstract: After being pretreated on ramie bast fiber by microbial retting, both single factor and multi-factorswere experimented during ramie lignocellulosic degrading with enzymes, these influential factors are pH valueconcentrations of enzymes and glucose, and methods for material treatment. The results show that, the highestrate of saccharification reaches 72. 361% at the beginning of pH 5. 0, Within a range of enzymes concentration,the rate of saccharification can be increased with the increase of enzymes; The optimal enzyme concentrations are5% of xylanase and 10%of cellulase, respectively The rate of saccharification is not influenced as glucose con-centration in the solution of lignocellulosic degrading is below 0.5%, and as over 0. 5% of glucose concentrationand with the increase of glucose in the solution, the rate of saccharification is decreased Mechanical treatment onaterial is beneficial for improving the efficiency of enzymatic degrading. The most optimum conditions for ramieenzymatic lignocellulosic degrading is pH 4.5-5.5, 8%-11% of cellulose concentration, below 0. 5% of glucoseconcentration and treatment of scissorssed and unwatered materialKey words: ramie; lignocellulose; enzymatic degrading influential factors中國煤化工CNMHG