釀酒科技2008年第7期(總第169期) LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2008N.7Tl.169高濃度發(fā)酵制備紅薯燃料乙醇的研究羅希,何華坤,劉莉,王紅霞,晏濤,龔大春(三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院湖北宣昌443002)摘要:研究了以鮮紅薯為原料制備高濃度紅薯燃料乙醇過(guò)程中高糖濃度和高酒濃度下酵母細(xì)胞生長(zhǎng)特性和還原糖濃度變化規(guī)律。發(fā)酵醪中添加活性物質(zhì),可以減小發(fā)酵液的滲透壓,提髙酵母的耐酒精能力。通過(guò)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,鮮紅薯高濃度發(fā)酵酒精度可達(dá)到15.%vol,噸酒精水消耗控制在6t左右,咆酒成本可降低200元關(guān)鍵詞:燃料乙醇;紅薯;高濃度發(fā)酵;酵母中圖分類號(hào):TS2622;TS2614文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1001-9286(2008)07-0032-04Research on High Gravity Fermentation for the productionof Fuel Alcohol by Sweet PotatoesLUO Xi, HE Hua-kun, LIU Li, WANG Hong-xia, YAN Tao and GONG Da-chun(Chemistry Life Science College of Three Gorges University, Yichang, Hubei 443002, ChinaAbstract: The growth characteristics of yeast cells and the change rules of reducing sugar concentration under high concentration of sugar andalcohol in the production of fuel alcohol by fresh sweet potatoes were investigated. The addition of bio-active substances in fermenting mashcould reduce the osmotic pressure of fermenting liquid and increase ethanol tolerance of yeast. Through orthogonal experiment L,(3"), the alco-hol concentration of fermenting liquid was up to 15.1 %vol, water consumption for per ton alcohol controlled at about 6 t, and the productioncost reduced by 200 RMB for each ton of alcohoL.Key words: fuel alcohol; sweet potato; high gravity fermentation; yeast化石資源作為一種不可再生的資源已日益枯竭,尋母在特殊環(huán)境下的生長(zhǎng)能力,最終實(shí)現(xiàn)紅薯的高濃度發(fā)找可再生的替代資源和能源,特別是新的液態(tài)燃料,成酵。期望降低發(fā)酵過(guò)程的水的消耗和精餾過(guò)程的能源消為維持人類社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的迫切需要耗乙醇是來(lái)自可再生資源的最有發(fā)展前景的液態(tài)燃1材料與方法料。在汽油中添加10%~15%酒精組成的乙醇汽油,已在我國(guó)東北、北京、上海、河南、湖北等地試用?！笆?1原料期間我國(guó)燃料乙醇產(chǎn)量達(dá)到130萬(wàn)t左右。但我國(guó)燃料紅薯:產(chǎn)地湖北宜昌,DNS法檢測(cè)得淀粉含量26%乙醇的生產(chǎn)主要用過(guò)剩糧食玉米、小麥生產(chǎn),原料緊缺,以上,選擇成熟好淀粉含量高、無(wú)霉?fàn)€、無(wú)病蟲害的鮮并容易引發(fā)糧食價(jià)格上漲,因此拓展生物質(zhì)原料,利用紅薯。非糧食的淀粉生物質(zhì)或非淀粉的纖維素生物質(zhì)作為原12主要試劑料,生產(chǎn)燃料乙醇,意義重大。高淀粉紅薯是一種工業(yè)用酵母抽提物、耐高溫活性干酵母為安琪酵母股份有的能源作物其淀粉含量在30%左右,用于制備燃料乙限公司提供。耐高溫a-淀粉酶(不小于4000g),北京醇是南方地區(qū)開(kāi)發(fā)生物能源的絕好原料。但其工藝主奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;糖化酶(500ug),湖要借用玉米乙醇工藝,存在廢水排放大、分離能耗高等南省津市市新型發(fā)酵有限責(zé)任公司。其他為國(guó)內(nèi)常規(guī)試問(wèn)題劑本文以高濃度發(fā)酵原理為指導(dǎo),通過(guò)添加活性物13主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備質(zhì),減小酒精抑制降低高糖濃度引起的滲透壓,提高酵基金項(xiàng)目:宜昌市科技攻關(guān)項(xiàng)目(A2007103-1)TYH中國(guó)煤化養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)CNMHG收稿日期:200804-14作者簡(jiǎn)介:何華坤(1986-),男,大學(xué)本科生。通訊作者:龔大春(1967-),男,生物化工博士,副教授碩士生導(dǎo)師,主要從事生物質(zhì)能的研究與開(kāi)發(fā)以及手性化合物的合成技術(shù)研究羅希,何華坤劉莉王紅霞,要濤典大春·高濃度發(fā)酵制備紅薯燃料乙醇的研究有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)紫外/可見(jiàn)光分光光度儀(上海1.8美譜達(dá)儀器有限公司),GC氣相分析儀(上海天美儀器1.61.4有限公司)等。1.214實(shí)驗(yàn)方法1.014.1DNs溶液的配制0.6取63g3,5-二硝基水楊酸溶于262mL2moL的氫氧化鈉溶液中。再將此溶液與500mL含有182g酒0.2石酸鉀鈉的熱水混合。向該溶液中再加入5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉,充分?jǐn)嚢枋怪芙?待溶液冷卻后,用水葡萄糖濃度(ng/mL)稀釋到1000mL。貯存于棕色試劑瓶中(需要在冰箱中圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線放置7d方可使用)般情況下,發(fā)酵醪液中酵母菌細(xì)胞的密度越高,142液體培養(yǎng)基定的時(shí)間、一定的容積內(nèi)產(chǎn)生的酒精就越多,發(fā)酵效KHPO40.5%MgSO40.2%、NaC10.%、CaCl2率就越高。但在一般的間歇發(fā)酵工藝中受發(fā)酵醪液中02%、NHSO05%,酵母抽提物0~10%,生物活性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量酒精代謝產(chǎn)物濃度及酵母菌自身生理物質(zhì)0~03%,蛋白陳1%。和遺傳等因素的影響醪液中的酵母菌細(xì)胞密度會(huì)有15分析檢測(cè)方法個(gè)極限值。對(duì)于高濃度酒精發(fā)酵來(lái)說(shuō),由于發(fā)酵醪液中1.5.1還原糖的葡萄糖的濃度比一般的發(fā)酵醪液中高出很多,此時(shí)加采用DNS法測(cè)定人酵母菌的數(shù)量也應(yīng)該比一般的間歇發(fā)酵醪液中要多,1.52pH值但是考慮到生產(chǎn)成本以及酵母菌個(gè)體間的相互影響,酵采用酸度計(jì)測(cè)定。母菌細(xì)胞的密度應(yīng)該增加到一個(gè)合理的范圍內(nèi),從而防1.5.3乙醇含量的測(cè)定止酵母菌因?yàn)檫^(guò)量增殖而消耗多余的原料糖,同時(shí)又能取出成熟發(fā)酵醪在600rmin離心機(jī)中離心保證酵母菌細(xì)胞正常生理代謝所需要的糖,實(shí)現(xiàn)良性發(fā)5min。用045μm過(guò)濾器過(guò)濾得到的液體樣品采用氣酵代謝。圖2是以活酵母數(shù)為縱坐標(biāo),反應(yīng)時(shí)間為橫坐相檢測(cè)。標(biāo)繪制的酵母在50h內(nèi)的生長(zhǎng)曲線圖。1.54紅薯中淀粉含量的測(cè)定取試樣15~2g,研碎,轉(zhuǎn)人250mL三角瓶中,加5.5人100mL2%鹽酸溶液。瓶口上安回流冷凝器或長(zhǎng)玻璃管,沸水浴3h。取出迅速冷卻。用20%氫氧化鈉溶液中X←曲批和至中性或微酸性。濾紙過(guò)濾濾液用500mL容量瓶接3.5收,用水充分洗滌殘?jiān)?然后用水定容,用DNS測(cè)溶液中糖含量,從而可折算出紅薯原料中淀粉含量。1.5.5水分測(cè)定將紅薯洗凈切碎,取10g放入蒸發(fā)皿中,于干燥箱時(shí)間〔h)中105℃溫度下干燥過(guò)夜,直到恒重為止。圖2計(jì)數(shù)觀察酵母生長(zhǎng)曲線2結(jié)果與分析由圖2可以看出,酵母的主要生長(zhǎng)階段在21h內(nèi)21葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制此階段酵母生長(zhǎng)最快、活細(xì)胞數(shù)量增加最多、在21h時(shí)通過(guò)線性回歸,得到葡萄糖濃度對(duì)吸光度的線性方產(chǎn)酒能力最強(qiáng)是發(fā)酵的主發(fā)酵階段。在32h后,酵母程為細(xì)胞數(shù)量明顯減少。OD=1868167C-0.01193R=0.997992.22還原糖濃度變化式中:C為葡萄糖的濃度,mgmL,糖的濃度可以根據(jù)測(cè)得的OD值和稀釋倍數(shù)對(duì)應(yīng)求出。淀粉含量根據(jù)還原糖的量折算。行糊中國(guó)煤化工淀粉和100水,進(jìn)活5min,調(diào)pH值至葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。4.2。CNMHG糖化4h加入液體培22鮮紅薯高濃度酒精發(fā)酵的影響因素岡養(yǎng)基(未加生物活性物質(zhì))中。調(diào)pH40~50,接種活化22.1酵母菌細(xì)胞密度34米釀酒科技2008年第7期(總第169期) LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2008N.7(Tol.169過(guò)的酵母05%。每3h測(cè)1次還原糖濃度并記錄實(shí)驗(yàn)?zāi)冈诟叩孜餄舛认碌陌l(fā)酵過(guò)程正常進(jìn)行。數(shù)據(jù),結(jié)果見(jiàn)圖3。2.25正交實(shí)驗(yàn)在液化和糖化及各營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,對(duì)不同酵母量、抗酒精試劑、酵母抽提物和抗?jié)B透壓試劑的添加進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。因素水平表見(jiàn)表l。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表1試驗(yàn)因素、水平水平醉母抽提物抗酒精試劑酵母量抗?jié)B透壓試劑0A(%)C(%)時(shí)間h)123357B20.40.5m2圖3還原糖濃度變化曲線由圖3可以看出,隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行,發(fā)酵液中序表2正交試驗(yàn)因素水平表L,(3),發(fā)酵72h的還原糖不斷被酵母利用產(chǎn)生酒精實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段酵母號(hào)ABCD(xL,20c)糖(3)()活性強(qiáng)、產(chǎn)酒精較快,發(fā)酵后期酵母由于環(huán)境的變化,酵母活性下降、產(chǎn)酒精能力降低,而且殘留的還原糖在522122213106668h時(shí)仍有3mgmL左右。還原糖濃度變化最快的時(shí)間在2313.30.4167.80h與22h之間,此時(shí)還原糖濃度急劇下降,是酵母發(fā)522320.9363酵產(chǎn)生酒精的主要時(shí)期。620.8266.3732.71.264.7223抗酒精的抑制作用832213.20.6667.3酒精是酵母菌的代謝產(chǎn)物,其會(huì)對(duì)酵母菌產(chǎn)生毒害912.60.7164.作用。隨著發(fā)酵醪液中酒精濃度的增加,乙醇可以進(jìn)入K16.7064.8865.1763.30到細(xì)胞膜的疏水區(qū)降低了疏水介質(zhì)的相互作用力。另826593690627659外,乙醇在疏水區(qū)的存在還會(huì)降低范德華力的作用,增R0.5661.4341.1004.467加細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)性和疏水區(qū)的極性,使細(xì)胞膜減弱對(duì)極F1.006.8323.81962.109F=19性分子自由交換的疏水性障礙作用。因此,在實(shí)驗(yàn)中添加抗酒精試劑,保護(hù)酵母細(xì)胞膜的活性物質(zhì)如聚多糖由表2極差結(jié)果分析表明:4個(gè)因素的最佳組合是異黃酮海藻糖和Twen80等,可以有效保護(hù)細(xì)胞膜A2B3C2D3,即:酵母抽提物4%,抗酒精劑B2,酵母量的疏水區(qū)域,提高細(xì)胞的耐酒精能力。添加0.5‰~4%,抗?jié)B透壓試劑D3。它們對(duì)發(fā)酵的影響程度為:抗1%的生物活性物質(zhì),可以將酒精度提高5%vol。滲透壓試劑>抗酒精劑>酵母量>酵母抽提物?？梢?jiàn)在224滲透壓的影響高濃度發(fā)酵過(guò)程中降低高濃度葡萄糖引起的滲透壓和高濃度發(fā)酵制備紅薯燃料乙醇的第一個(gè)關(guān)鍵是如提高酵母的耐酒精能力是實(shí)現(xiàn)高濃度發(fā)酵制備紅薯燃何在高葡萄糖濃度和高乙醇濃度下使酵母保持良好的料乙醇的關(guān)鍵。通過(guò)方差分析發(fā)現(xiàn)抗?jié)B透試劑的選擇繁殖狀態(tài)。在高濃度下發(fā)酵液中的滲透壓會(huì)升高,使酵非常重要,是實(shí)現(xiàn)高濃度發(fā)酵的顯著影響因素。其F比為母細(xì)胞變形甚至使酵母營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從膜內(nèi)流失到膜外,最62109,遠(yuǎn)大于F臨界=19后導(dǎo)致酵母死亡。同時(shí)高乙醇濃度也會(huì)對(duì)酵母產(chǎn)生毒226最佳發(fā)酵工藝的驗(yàn)證性。因此,在發(fā)酵培養(yǎng)基中必須添加生物活性物質(zhì),一方用本實(shí)驗(yàn)所確定的最優(yōu)培養(yǎng)基成分、最優(yōu)液化、糖面降低發(fā)酵液中的滲透壓,改善酵母的代謝環(huán)境,另化條件、最適底物濃度、最適發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵。方面提高酵母細(xì)胞持續(xù)的生長(zhǎng)能力和在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生取一個(gè)錐形瓶,加入經(jīng)蒸煮、研碎的紅薯20g,加水高濃度的乙醇。比為12進(jìn)行糊化。加入a-淀粉酶1%,于70℃水中液實(shí)驗(yàn)研究表明在高濃度發(fā)酵中加入多元醇抗?jié)B透化2b滅活5m調(diào)H值42加糖化酶1%,于60℃壓試劑啊如麥角甾醇、山梨醇等,使酵母菌生長(zhǎng)良好,可水中中國(guó)煤化工透壓試劑D和抗酒精以部分起到抵抗高濃度葡萄糖所造成的滲透壓的影響,劑BCNMHG~45,接種用2%的葡使酵母菌的發(fā)酵強(qiáng)度處于較高的水平。添加005%的萄糖溶液活化過(guò)的酵母1%,控溫發(fā)酵72h。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)多元醇,可降低葡萄糖高濃度引起的高滲透壓,保證酵結(jié)果為:殘?zhí)菫?42%;酒精度為15%0;出酒率為羅希,何華坤,劉莉,王紅霞,要濤,糞大春·高濃度發(fā)酵制備紅薯燃料乙醇的研究76.5%。參考文獻(xiàn)3結(jié)論[]龔大春,田毅紅李德瑩龔美珍纖維素乙醇的研究進(jìn)展門化學(xué)與生物工程,2007,(1):4-73.1實(shí)驗(yàn)通過(guò)解決紅薯燃料乙醇的濃醪發(fā)酵系列關(guān)鍵2]姜勇,李春玲,孫承國(guó)等對(duì)玉米生產(chǎn)酒精過(guò)程中酵母影響問(wèn)題,構(gòu)建高濃度發(fā)酵制備紅薯燃料乙醇新技術(shù)。通因素的研究門釀酒科技,2006,(3):91-93過(guò)添加活性物質(zhì)減小滲透壓,緩解滲透壓對(duì)酵母產(chǎn)酒3]沈力勻工業(yè)發(fā)酵分析[M北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,的影響,提高了酵母的抗酒精抑制作用。最終實(shí)現(xiàn)了紅1980.15-17薯的高濃度發(fā)酵,將發(fā)酵酒度提高到151%vol[4]陳堅(jiān)高細(xì)胞密度發(fā)酵技術(shù)[M北京:化學(xué)工業(yè)出版社3.2采用鮮紅薯直接液化糖化和高濃度發(fā)酵,可以使2006.109-130.噸酒精水消耗控制在6t左右,大幅度減少能耗,降低酒5] Reddy lv.a, Reddy O V.S. Rapid and enhanced pr精生產(chǎn)的綜合成本,并減輕環(huán)保壓力。據(jù)估算,如果將酒ethanol in very high gravity (VHG)sugar fermentation bySaccharomyces cerevisiae: Role of finger millet(Eleusine度從8%vol~10%vol提高到14%vol~15%vol,噸酒coracana L )flour[J] Process Biochemistry, 2006. 41: 726-729將減少蒸汽近1t,減少?gòu)U水近4~5t,噸酒成本降低6侯保朝杜風(fēng)光郭永豪,等高濃度酒精發(fā)酵[]釀酒科技,200元,10萬(wàn)t燃料乙醇將節(jié)約成本2千萬(wàn)元,同時(shí)減2005,130(4):93-97少?gòu)U水排放,綜合效益相當(dāng)可觀。2a品奶決況況況》》加加》》》加》加護(hù)護(hù)護(hù)》》》》加如器》(上接第31頁(yè))由圖6~圖8可知,基因工程菌株Y2的20代菌株現(xiàn)象嚴(yán)重,從而影響其抗氧化能力的穩(wěn)定性。因此,采用的SO2生成量為21.51mg/L,TBA值為3678,DPH自酵母基因組整合表達(dá)SSU1解決基因工程菌株遺傳穩(wěn)由基清除率為70.3%,分別較第1代菌株下降329%,定性問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究。升高9.0%,下降124%;而原株M8的20代菌株較第參考文獻(xiàn):1代菌株的SO2生成量、TBA值和DPPH自由基清除率[I] Robbins TL, Boillat B Control of odors in the brewing and food均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明,基因工程菌株Y2的遺傳穩(wěn)定processing industries[J]. MBAA TQ. 2002, 39: 29-31性比原株M8差。[2] Park H, Bakalinsky AT. SSUl mediates sulphite efflux in3討論Saccharomyces cerevisiae[]. Yeast. 2000,(16): 881-888[3]丁書美陳葉福,肖冬光啤酒中HS測(cè)定方法的研究[釀實(shí)驗(yàn)表明,啤酒酵母基因工程菌株Y2中SSUI基酒,2006,33(6):94-95因得到多克隆活性表達(dá),較原株啤酒酵母M8的SO2生4]丁書美陳葉福,肖冬光,等啤酒中SO2測(cè)定方法的研究[A成量提高808%,DPH自由基清除率提高382%中國(guó)發(fā)酵工程學(xué)術(shù)研究會(huì)論文集[C2006TBA值下降149%,HS生成量相差不大,啤酒發(fā)酵性[5]杜連祥等.丁業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)M]天津:天津科學(xué)技術(shù)能良好,抗氧化能力明顯提高啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性得到改出版社,1992善。由于本實(shí)驗(yàn)釆用酵母附加型表達(dá)載體,在無(wú)選擇壓]王丹紅TBA值在啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性預(yù)測(cè)中的應(yīng)用門中國(guó)啤力的發(fā)酵條件下,不能穩(wěn)定地存在于酵母細(xì)胞中。因此酒,2002,(9):44-46隨著基因工程菌株Y2的不斷傳代,重組表達(dá)載體丟失7嚴(yán)敏李崎,顧國(guó)賢利用DPH自由基清除率評(píng)價(jià)啤酒內(nèi)源性抗氧化能力門食品工業(yè)科技,2005,(8):82-83中聯(lián)新型活用籽問(wèn)嵫本刊訊:由四川省申聯(lián)生物科技有限責(zé)任公司、四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院、四川省天府名優(yōu)酒研究中心等幾家科研單位利用超臨界CO2萃取技術(shù),有效提取丟糟、黃水、底鍋水中的香味成分生產(chǎn)出的新型酒用香料,經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)證明,對(duì)提高酒質(zhì)、增加酒體復(fù)雜微量成分有明顯效果。傳統(tǒng)濃香型曲酒發(fā)酵過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生丟精、黃水、底鍋水等發(fā)酵副產(chǎn)物質(zhì)。其中,丟糟是面糟發(fā)酵經(jīng)固態(tài)蒸餾取酒后的殘褘;黃水是發(fā)酵過(guò)程中在窖底形成的黃褐色淋漿水;底鍋水是蒸餾過(guò)程中水蒸汽蕙發(fā)遇酒酷后,冷凝回落形成于鍋底的蒸漿水。它們中+都富含大量的香味物質(zhì)成分,有殘淀、還原糖、有機(jī)酸、酯類、醇類、羥基化中國(guó)煤化工環(huán)類化合物等。但由于技術(shù)服制,酒廠都將其直接扔拌既沒(méi)有經(jīng)濟(jì)效益,又污染環(huán)境。CNMHG據(jù)悉,從白酒發(fā)酵副產(chǎn)物中有效提取香味物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)化為酒用香兀宀~刀,巴是未來(lái)白酒添加劑的發(fā)展方向?；诖?四川中聯(lián)生物科技有限責(zé)任公司聯(lián)合四川省天府名優(yōu)酒研究中心、四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院等業(yè)內(nèi)科研院所經(jīng)過(guò)積契砑攻關(guān),終于實(shí)現(xiàn)了鉍塹窄公息酒岑阡塑產(chǎn)中褪出査唪質(zhì)矛轉(zhuǎn)華玅潭厚(江源)-+→++-→++