436重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報2001年第26卷第4期(Joumal of Chongqing Medical Lniversity 2001. VoI 26. No.4)文章編號:0253 - 3626(2001)04 - 0436 -03.RAPD的建立及優(yōu)化研究蒲淑萍',玉希,段昌柱'(1.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室重慶4006;2 重慶職工醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室重慶 40050)[摘要]目的:建立優(yōu)化的RAPI)反應(yīng)條件,為進 步進行遺傳監(jiān)控研究奠定基礎(chǔ)。方法;按常規(guī)方法制備小鼠基因組DNA.在-定的RAPD)- PCR反應(yīng)條件下分別改變各組份濃度及退火溫度。擴增產(chǎn)物在含溴化乙錠的1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳,紫外透射儀上觀察照相、結(jié)果:當Mg*濃度為1. 5mmx)/L.4種dNTPs各為150;mo!/L,Taq酶為1. sUi,引物為0. 2moul/..模板INA為50ng.退火溫度為38“.RAPD-PCR擴增效果好。結(jié)論:在優(yōu)化的條件下規(guī)范操作,RAPD的穩(wěn)定性.重復(fù)性好[關(guān)鍵詞] RAPI);基因組DNA:優(yōu)化反應(yīng)條件[中國圍書分類法分類號] R394. 33(文獻標識碼] B(收稿日期] 2001-01 -03Screening the optimized condition of RAPD - PCRPU Shu- pring ,et ul(Iepartment oi IBiology ,College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University )[:Abstract] Obecive :To establish the optimized RAPD- PCR reaction conditions for furher genetic monitor-ing sudy. Methods : :Altering the cuncentrations of the reaction components and the annealing lemperaturt ofRAPI)- P(R. PCR products from RAPD were elcctrophoretically separated in agarose gels and banding profileswert visualized by ethidium bromide saining. Results : RAPD - PCR reactions were performed in duplicationwith 50ng of genonic DNA. I50pmol/L each dNTP,0. 2pxmol/L primer, 1.5mmol/L magnesium chlride,1. 5units of Taq prlxmerase, annealing at 38亡. Under thee conditions RAPD method is stable and reproducible.Conclusion :'Ihe optimized RAPT) - PCR reaction conditions were cstablished in this study.[Key words] Randor anplified polynorphic DNA( RAPD) ;Grenonic DNA:Optimal reactin conditions1990年Willians "和Welshl]等幾乎同時將隨或發(fā)生分子量的改變,形成多態(tài)DNA片段.通過對機引物與PCR技術(shù)結(jié)合,用于復(fù)雜基因組DNA指PCR擴增產(chǎn)物的檢測即可找到基丙組DNA在這些紋分析,Williams等稱之為隨機擴增多態(tài)DNA(ran-區(qū)域的多態(tài)性。RAPD 技術(shù)的特點之一是使用隨機dom anpified polymorphic DNA. RAPD)分析,引物,通過系列引物可檢測到覆蓋整個基因組范Welsh等稱之為AP - PCR ( arhitrarily primed圍的遺傳改變.而無須預(yù)先了解被測基因組相關(guān)分PCR): RAPD與AP- PCR并尤本質(zhì)的區(qū)別,均為子生物學(xué)信息。另一顯著的優(yōu)點在于RAPD技術(shù)種基于PCR方法,應(yīng)用單一引物的DXA多態(tài)檢相對簡單、快捷、實驗成本較低，加之有大量商品化測技術(shù).該技術(shù)利用一系列單-的喊基序列隨機排的RAPD引物,可對任何生物的遺傳變異進行基因列的矩寡核苷酸為引物.對基囚組DNA進行PCR分型其因型鑒定擴增.每引物同基因組DNA序列有其特定的結(jié)因而中國煤化工的外七廣泛應(yīng)用合信點.如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DN:A片段插于動YHCNM HG國的構(gòu)建,狹病人，缺失或堿基突變,就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點診斷,基因分離等:隨機引物法亦已用于檢測大的分布發(fā)生相應(yīng)的變化.從而使擴增產(chǎn)物增加缺少腸癌,卵巢瘺、肺癌、皮膚癌.腦膜留等的基因組不穩(wěn)序青數(shù)搪女蘆i的2- ，女。重慶江津人、進海。確士 主要研定性及分離差異INA片段,并將其克隆和定位:“氣方向.動境楚人類疾確遺傳鳴RAPD反應(yīng)非常靈敏,但穩(wěn)定性.重復(fù)性不太令人滿.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2001年第26卷第4期(Journal of Chongaing Medicai University 2001. Vol. 26.No. 4)_437 __意:為了克服這一缺陷,本研究對RAPD-PCR反溫度。實驗結(jié)果表明,當Mg2*濃度為1. 5mmol/L,應(yīng)的各項組份.諸如模板DNA、Taq酶、鎂離子.引4種dNTPs各為150pmol/L,Taq酶為1.5U,引物物、dNTP等進行濃度梯度比較實驗,以期建立最優(yōu)為0.2μmol/L,模板DNA為50ng, 退火溫度為反應(yīng)條件。同時使用同一PCR儀,同一公司生產(chǎn)的38C ,擴增效果較理想。經(jīng)大量實驗證明,在此條件Taq酶,獲得穩(wěn)定性、重復(fù)性良好的擴增產(chǎn)物。下規(guī)范操作,RAPD的穩(wěn)定性、重復(fù)性好:2.1 退火溫度對PCR的影響1材料與方法實驗中分別設(shè)置35t: , 38C,40T ,42個,45T退火,溫度過低(3SC )則特異性差,背景深;溫度過11材料高(45C),擴增帶減少、變?nèi)?擴增效率低，在保證(C;,BL/6] 小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,取小擴增效率的同時又要達到增強特異件的目的.我們鼠肝臟組織備用。認為38C較適宜。退火溫度較低,能保證短核苷酸1.2 試劑與引物引物與模板的穩(wěn)定配對,同時也允許了適當?shù)腻e配，10 < bffr.Taq DNA聚合酶MgCl、dNTP均為上海生以大引物在基因組DNA中配對的隨機性物T.程公司產(chǎn)品。隨機引物為美國hperon Tecunologies公司產(chǎn)品.每- 引2.2 Mg°濃度對PCR的影響物為10個堿基的寡聚核許酸.實驗用引物為AB- 0320 -Mg?*直接影響聚合酶的活性,它使雙鏈DNAKit2-2即(:AB2-2):GGTGRGHAA;.B7-I:的Tm值增加, Mg*'與dNTPs形成的復(fù)合物才是CAHCOC(; AH8 - 12: GACGCGAACC; AR9 - 7:聚合酶作用的底物，因此Mg2*濃度對PCR擴增TCCTCCCGA等.的效率和特異性具顯著影響[7]。實驗中分別以13 基因組DNA的制備0. 5mmol/L.I. 5mmol/L .2.0mmol/L、2.5mmol/L、取小鼠肝臟組織適量,加少量液氟研碎,按常規(guī)方法加3.0mmol/L的Mg2*濃度進行擴增,結(jié)果如圖1,濃人消化液(10runol/L Tns- HCI,pH8. 0, 10mno/L EDTA.度高則出現(xiàn)非特異擴增,背景深;過低則酶活性顯著0 5% SDS.20/g /ml R.Nase, I00pg/ml蛋白酶K)消化.用酚、下降。由于反應(yīng)混合物的模板DNA、引物、dNTPs氯仿提取DNA,乙醇沉淀.TE溶解,置4C冰箱備用:等均可結(jié)合Mg2* ,從而降低其游離濃度,特別是過.4 PCR儀:美國PE2400型量的dNTPs使其大量減少,導(dǎo)致P(R產(chǎn)物減少:1.5 RAPD- PCR反應(yīng)條件及擴增程序參照Wlias!"I等的方法稍作修改后進行。反應(yīng)總體從實驗結(jié)果可知1. 5~ 2.0mmol/L的Mg'濃度其積為25u,其中含2. 5μ1 l0x bufer( 10mmol/L Tris- HC1.pH擴增效率和特異性較理想。bxe8δ. 3. 50mmol/L. KCI, 0. 001%明膠), 1. 5mmol/L MgCh，150umol/L dNTP,隨機引物0. 2umol/L,25 - 50ng 基因組DN.A." Iag DNA聚合酶1.5個單位。反應(yīng)程序為:94C預(yù)變性2min;94C變性1nin, 38C復(fù)性1min, 72七延伸2min,40個循環(huán)后,72C延伸10min。在以上條件下,分別改變退火1543溫度、模板DNA濃度dNTP濃度.MgCl2濃度.Taq酶濃度、引物濃度,每次僅改變一個PCR參數(shù),并保持其它條件不994變.擴增產(chǎn)物在含溴化乙錠的1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳,紫697515外透射儀上觀察照相,3772結(jié)果與討論中國煤化工雖然RAPD技術(shù)有許多其它分子生物學(xué)技術(shù)a0.5n.fYHCNMH GL2.0m1L1無法比擬的優(yōu)點7.8. ,由于RAPD技術(shù)是以PCR技d. 2.5umnol/4.e.3.0mmol/L術(shù)為基礎(chǔ),加之短引物的使用及其在擴增過程中不(M:Maker)完全配對，影響最終產(chǎn)物獲得的因素較多,其中最重2.3 dNTPs濃度對PCR的影響要的是衣數(shù)據(jù)dNTPs、引物、模板D:NA濃度和退火dNTPs是PCR反應(yīng)的底物,其濃度過低則反應(yīng)38重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報2001年第26卷第4期(!Jumal of Chongqing Medial Uhiversty 2001. Vol 26. No.4)速度和產(chǎn)量下降,過高則特異性下降。實驗中2.5 模板 DNA濃度對PCR的影響dNTPs的濃度分別為50ymo!/L、 100umo/L.模板DNA用量從50ng至800ng.擴增結(jié)果基150ymolL20gumol/L.250xmol/L(圖2)。在100本-致(圖4)。模板DNA用量在+倍左右范圍內(nèi)~ 250)xmol/L之間擴增效果較好,故選擇150pxmol/ 變動都不會影響擴 增結(jié)果,說明RAPD對模板濃度L用于實驗.要求不十分嚴格。但本實驗證明若模板DNA降解2.4 Taq酶濃度對PCR的影響嚴重或質(zhì)量太差(如含雜質(zhì)過多,DNA提取過程中如圖3,25μI反應(yīng)體系中Taq酶的用量分別為殘留的蛋白酶、核酸酶、SDS、酚、氣仿等,可抑制0.5U、1.0U、2.0U.3.0U、4.0U,當Taq酶為0.5UTaq酶活性),出現(xiàn)擴增產(chǎn)物減少,背景彌散或無擴時,PCR產(chǎn)物量極少, Taq酶為3U以上時，出現(xiàn)了增產(chǎn)物191。為了避免模板嚴重降解,在提取DVA彌散狀背景,非特異產(chǎn)物增加,Taq酶為1-2U時時應(yīng)盡量避免劇烈或不恰當?shù)牟僮?以便獲得大分效果較好:子量的模板。實驗中也曾用高濃度的基因組DNAdcbaMp作為模板,結(jié)果擴增產(chǎn)物很少或無擴增產(chǎn)物,這是因為模板DNA量大,其中抑制物量也可能增加,致使擴增效率下降。同時反應(yīng)空間過分擁擠叮能也不利.于效率的提高。在對腫瘤與其相應(yīng)止:常組織不同個體,不同品系間進行比較時模板濃度應(yīng)盡量保持1543致:9942.6 引物濃度對PCR的影響引物濃度過低時會影響產(chǎn)量,過高時一則浪費.697515二則會出現(xiàn)非特異擴增9。實驗中引物濃度梯度為0. lμmol/L.0. 2μmol/L .0.4umol/L .0.6umol/L、3770. 8ymnol/L)。0. 2μmol/L引物濃度最適宜:用2 dNTPs濃魔對RAPD結(jié)果的影響巾a.50;mol Lb. 100umolAL.c. l501mol/Ld. 20%m 1.e. 250umo!/L(M:Marker)bp97團4模板DNA濃度對RAPD結(jié)果的影響a.50ngb. 100ngc. 200ngd. 400nge.600ng1. S00ng中國煤化工YHCNMHG保持實驗用品的一致性，如使用同- - 批次的TaqDNA聚合酶及同圍: Taq 酶濃度對RAPD)結(jié)果的影響-臺PCR擴增儀等。建立最優(yōu)反應(yīng)條件,嚴格規(guī)范a0孔L 1.0c.2.0U操作.可獲得重復(fù)性、穩(wěn)定性好的實驗結(jié)果c3.00e↓0L萬方數(shù)榍larker)(下轉(zhuǎn)第442頁)一442一1慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報2001年第26卷第4期(Jumal of Changaing Medical University 2001. Vol 26. No.4)染性休克的病理變化的后期階段起著重要的作用,nisns of cell simuation by barteral endotoxinJ]. Annu Rev在這一過程中可能屬于后期細胞因子,與該病理變Immunol, 1995;13:437- 457.化嚴重程度及其預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示，Wright SD, KRanas RA. Toblas IS.et al. CD.a化:eplur當E - STL< 150ng/ml,IL- 10< 19pg/ml時.有感for complexes of lipupxly srcharide (LPS) aud LPS bnding ;染進一步加重的可能;E - SLT> 328ng/nl,IL - 10proein[J]. Science, 1990;249:1431- 1433.[4] Bevilacqua MP, Stengelin s, (imbrane MA,et al. En->40pn/ml 時,患者預(yù)后不良，甚至有死亡的可能。duthelial leukocyle adhesion molecule - 1: an inducible receptor因此,我們認為同時測定IL- 10和E- SLT血清水for neutrophils related to complenen1 regulatory prstein and平在反映感染或感染性休克嚴重程度和預(yù)后上具有l(wèi)ecinJ]. Science, 1989;243:1160 - 1165.-定的價值和意義。[5] Bogdan C, Vodoworz y, Nathan C. Macruphage deactivn-本研究表明，sCD和TNF-a在術(shù)后并發(fā)嚴重tionby iterleukin- 10.]].」 Exp Mud. 1991; 174: 1549 -感染的早期病理過程中起著重要的作用,與早期感1555.染密切相關(guān);IL- 10和E- SLT可能在感染病理變6] Bussolati H,Marian> F .Mrntrucchin (i.c1 al. Mudulatory化過程的后期起著重要的作用,屬后期細胞因子,與elfet of Inteleukn - 10 (4 the pradu:tiun of platelet”aclivat.ing factor aund suproxide ariun bs bhuman leukxy1es.J. Im.感染嚴重程度密切相關(guān)。F.- SLT JL.- 10和sCD)4是反映術(shù)后并發(fā)感染病人病情變化和預(yù)后的可靠指nunolngy. 1997;9);440 - 447..7」 Kasun I, Surneter RM. L.ukacs NW,el小Repulatun of標之一:neurophil - derivd chenx kne expnsion by IL.- 10J].1 In-munl. 1997;152:3559 - 3569.參考文獻8] Hickey MJ. Isckuz AC . Keinhardlt PH,et ail. Findk gtrnusinterlrukin- 10 regulates hem rynami: puraneler<. leukxcyet -1] Clauser MP. Zaneiti G, Beungrtner JD. et al. Sepsisenduthelial cell neractions, and mictovascular permerbilityshock;: ptogneisJ]. .1ce.e991:138:732 - 736.during enduxenia!]. 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