934微生物學(xué)通報200年34(5)合成乙醇重組乳桿菌的研究夏子芳王正祥”(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室和江南大學(xué)生物工程學(xué)院無錫214122)摘要:將含有2 monona mobi乙醇合成途徑的關(guān)鍵酶基因的片段 Ptac-pde和 PtacadhB,分別/同時接入pHY3O0PLK以及 pBBRIMCS5載體中,得到了 pHY-PA、 PBBR-PA等重組質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)化入幾株乳桿菌。在42℃下進行乙醇發(fā)酵試驗,結(jié)果表明:在 Lactobacillus plantarum CICIM B00中同時引入基因pdk、adhB有效地將碳代謝流導(dǎo)向了產(chǎn)乙醇方向重組菌Bo080(pHY-PA)發(fā)酵67%葡萄糖60h分別產(chǎn)生0.4%(VV)乙醇,為原始菌B000的67倍;而將pd、aihB基因同時引入L. amylotonu B0112和L, acidophilus B00,能檢測到相當于原始菌2倍的乙醇產(chǎn)出。在重組菌發(fā)酵過程中,仍有大量的乳酸產(chǎn)出,在引人產(chǎn)乙醇基因的同時敲除乳酸脫氫酶基因,將有可能使乳桿菌的代謝流向更有效地轉(zhuǎn)向產(chǎn)乙醇途徑。關(guān)鍵詞:乳桿菌,乙醇, Ptac-pdc,Pc~adhB中圖分類號:Q78文獻標識碼:A文章編號:0253-2654(200705093405Recombinant Lactobacilli for Ethanol ProductionXIA Zi-FWANG Zheng.Key Laboratory of.Ministry of Education and School of Biotechnoogy, Wuri 214122Abstract: Recombinant plasmids pHY-PA, PBBR-PA were constructed in which genes pde and adhB were placed under the control o Lac promoter,respectively, and had successfully expresed in Escherichia coli. Then these recombinant plasmids were electroporated into lactobacill strains forethanol production. Preliminary ethanol fermentation using these Lactobacillus strains and their recombinants was carried out using 42C asfermentation temperature. The results indicated that introducing pdc and adhB, athanologenic pathway was succesfully constructed in L plantarumICIM B0080. 0.4%(v/V)ethanol wes detected at the end of fermentation with 6.7% glucofold of cthanol production was detected in L. amylowanus B0112(pHY-PA)and L, acidophil B0068(pBBR-PA). Introducing bothadh B, and meanwhile knock-outing the lactate dehydrogmase gene may better convert carbon flux to ethanologenic directionKey words: Lactobacilus, Ethanol, Pgac pde, Ptac-adh B乳桿菌是一類革蘭氏陽性兼性厭氧菌,適宜生產(chǎn)條件。因此,對乳桿菌的代謝途徑進行改造,有長溫度髙達40℃~50℃,能在較低的pH和較高鹽望獲得新型乙醇發(fā)酵菌株。另一方面,乳桿菌作為濃度的環(huán)境下生長;其中大多數(shù)能夠代謝包括五碳發(fā)酵乳制品的主要生產(chǎn)菌種適量乙醇的產(chǎn)出有利糖和六碳糖在內(nèi)的多種糖類;能產(chǎn)生具有抑菌或殺于食品風味的改善能與酸類物質(zhì)形成特有的香菌作用的細菌素,在發(fā)酵生產(chǎn)中能起到抑制其他細味給人以提神刺激的感受3;發(fā)酵乳制品中的微量菌的作用。同時,乳桿菌是目前基于酵母菌的乙醇乙醇能促進消化腺機能增強刺激腸胃蠕動,促進發(fā)酵中的主要污染菌2,與酵母競爭性利用培養(yǎng)有機體的代謝”基中的碳源和各種營養(yǎng)成份,其代謝產(chǎn)物能影響酵乳桿菌中,代謝產(chǎn)生的大量丙酮酸經(jīng)乳酸脫氫母的生長,以致酒精產(chǎn)量的降低;但這也從另一個酶(LDH;111.27)催化而轉(zhuǎn)化為乳酸,通過強化細側(cè)面反映出乳桿菌能夠適應(yīng)乙醇發(fā)酵過程中的生胞內(nèi)的丙酮酸脫羧酶(PDC;EC4111)和乙醇脫新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(No.NCET04904)TYH中國煤化工擴增目標途徑,是CNMHG通訊作者Emi:mwag@syt.dm,cn收稿日期:200701-19,修回日期:200704022007年34(5)微生物學(xué)通報935構(gòu)建產(chǎn)乙醇乳桿菌的主要策略。本研究以已實現(xiàn)植物乳桿菌( Lactobacillus plantarum)ccM在E.co中表達的重組質(zhì)粒 pEtac-PA°為基礎(chǔ)構(gòu)B00、噬淀粉乳桿菌(L. amyloworus)B012、嗜酸乳建了 pHY-PA, PBBR-PA系列質(zhì)粒。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建桿菌(L. acidophilus)B0068,克隆宿主茵大腸桿菌乳桿菌重組菌探索重組乳桿菌的乙醇合成能力。( Escherichia coli)JM109,由江南大學(xué)中國高校工業(yè)1材料和方法微生物資源和信息中心( CICIM-CU,htp:/ cicim-custu. edu,cn)保藏。本研究中所使用及構(gòu)建的菌株1.1菌株和質(zhì)粒和質(zhì)粒見表1。麥1菌株和質(zhì)粒Strain or plasmidCharacteristies and descriptionSource or referenceStrainsLactobacill plantarum B0080wild-type strainLsolated from pickle fermentation facilityL. amylovora B01 12Wild-type strain, capable of raw starch degrading[7]wild-type strain,kowph toleranceEscherichia coli JM109CICIM-CUEtac-PAKanr: harboring pde and adh B that were placed under the control d [6]Amp, Tet: E. aodi- Bacillu sp, shuttle vectorCICIM-CUAmp, Tet': harboring Ptac-ad BAmp, Tetr: harboring both Ptacpde and PRac-adhBpBBRIMCS-SGm; board-boet-range veetorCHCIM-CUpBBR-PAGm: harboring both Ptac- pde and Ptac-adhBThis work12培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件14DNA操作技術(shù)乳桿菌的培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基(每升含有10gDNA片段膠回收、產(chǎn)物純化用華舜試劑盒進牛肉膏,10g蛋白胨,5g酵母抽提物,20g葡萄糖,1g行。質(zhì)粒DNA的提取酶切連接轉(zhuǎn)化等參照文獻吐溫80,2gK2HPO3,5g乙酸鈉,2g檸檬酸二銨,0.2g[8進行。MgO4·7H10,0.05 g EnSO4HO,pH6,2~6,5)。在1.5轉(zhuǎn)化方法42℃靜置培養(yǎng)24h~48h。含13%瓊脂的固體MRS乳桿菌的電轉(zhuǎn)化按照文獻[9]進行。大腸桿菌培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗生素)用于轉(zhuǎn)化子的篩選和計數(shù)。的轉(zhuǎn)化按照文獻[8]進行。大腸桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基(每升含有10g胰1.6酶活測定蛋白胨、5g酵母浸提物、10 g NaCI),37℃下培養(yǎng)。含重組子用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,離心收集菌1.3%瓊脂的培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗生素)用于轉(zhuǎn)化子的體以磷酸鹽緩沖液(pH6.5)洗滌懸浮,超聲波破篩選。壁。酶活測定參照文獻[6]進行。13薛與試劑1.7發(fā)酵試牛小腸堿性磷酸酶(CLAP)、T4DNA連接酶、各以含有67%葡萄糖的MRs培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)種限制性內(nèi)切酶和蛋白質(zhì)分子量標準均為晶美生基250mL三角瓶中裝液量為50mL,每瓶加入2g物工程有限公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒為上海華瞬生CaC03中國煤化工夜中葡萄糖和乳物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。其他試劑藥品為國產(chǎn)或進酸含CNMHG農(nóng)度采用氣相色口的分析純和生化試劑。譜法測定,色譜參數(shù)為:汽化室溫度200℃,檢測器936微生物學(xué)通報2007年34(5)(HID)溫度260℃,傳輸線溫度130℃。載氣N2壓力上,構(gòu)建pHY-pdc、pHY-adh、 pHY-PA,和pBR-PA。5ka,流量2ml/mn;助燃氣空氣流量400mL/mn;首先以BamH和Sa酶切質(zhì)粒 pEtac-PA,同時回收燃氣H2流量47mL/min。頂空瓶平衡溫度:70℃,平 Ptac-pda(約23kb)和 Ptac-adh B(約16kb)片段。將衡時間:30min。前者插入 pHY300PLK的BamH位點,得到pHY-pd;將后者插人以BamH和 salI酶切的2結(jié)果pHY3K載體,得到 pHY-adh;再將 Ptac-pdc片2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建段插入pHY-adh的BamH位點,得到 PHY-PA(圖在本實驗室先期構(gòu)建的質(zhì)粒 pEtac-PA的基礎(chǔ))采用相似方法構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pBPABamH IBamH IBamH IPiac-adhAPr PHY300PLKpHYadh6.4 kbBamH IY-PA圖!重組質(zhì)粒pHY-pd、 pHY-adh、 PHY-PA的構(gòu)建過程22重組乳桿菌PDC、ADH酶活測定2.3重組菌的初步酒精發(fā)酵對重組菌中的PDC和ADH酶活進行了測定挑取各重組菌及原始菌單菌落接種于10mL含(表2)。酶活測定的結(jié)果表明,pdk、adhB基因在有相應(yīng)抗生素的MS培養(yǎng)基中,42℃靜置培養(yǎng)過夜L. plantarum E0080中成功實現(xiàn)表達。對后將其作為種子液以1%(VV)接種到50mL含約L. acidophilus B008、L. amylowonus Be011及其相應(yīng)67%葡萄糖的MRS培養(yǎng)基,其中加入了2 g caco3,重組菌進行PDC和ADH酶活測定結(jié)果同樣表明:4℃n中國煤化工60h:L. plantarum重組菌的PDC和ADH酶活均相對于其原始菌株有BCNMHG約0.6%(vv)所提高(表2),ph、ahB基因在這兩株乳桿菌中同的乙浮;重組圖boo(pHY-ah)Bxp( pHY-PA)分樣實現(xiàn)了表達。別產(chǎn)生033%0.4%(VV)乙醇(圖2)。2007年34(5)微生物學(xué)通報囊2重組菌中PDC和ADH酶活Specific activitie(U/mgBOOS0 B008D(pHYpde)B0080(pHlY-adh) BO080(pHY-PA) B0068 B0068(pBBR-PA) B0112 B0112(pHY-PA)0.15820.2730ADH0.32300.34602.73023.31630.09880.5018圖2 lactobacillus plantarum及重組菌的酒精發(fā)酵根據(jù)酶活測定和乙醇發(fā)酵試驗結(jié)果各重組菌3討論的PDC的酶活為原始菌的13~19倍,重組菌的乙乳桿菌能代謝多種糖類,能在較為嚴峻的環(huán)境醇產(chǎn)量和ADH酶活成正相關(guān):B0080(pHY-pdk)和條件下生長,是發(fā)酵產(chǎn)乙醇的合適改造候選菌。但原始菌相近,只能產(chǎn)生約0.006%(V/V)的微量乙在乳桿菌中,代謝產(chǎn)生的大量丙酮酸都經(jīng)乳酸脫氫醇;在B00(pHY-ah)、B080( pHY-PA)中能檢測酶(LDH;11.127)的催化而轉(zhuǎn)化為乳酸僅有極少到約為原始菌10倍的ADH酶活,同時兩重組菌發(fā)量的乙醇經(jīng)異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生。將“產(chǎn)乙醇基因”酵6.7%葡萄糖60h分別產(chǎn)生0.33%、0.4%(ⅥV)引入乳桿菌是構(gòu)建產(chǎn)乙醇的乳桿菌的主要策略。乙醇(圖2);且BO080( pHY-PA)的乙醇產(chǎn)量比本研究中三菌株的最適生長溫度約為42℃,適B∞080( pHY-adh)略高,說明在L. plantarum B0080于目前發(fā)酵工廠中普遍使用的發(fā)酵培養(yǎng)溫度,同中同時引入基因pde、ahB最有效地將碳代謝流導(dǎo)時較高的發(fā)酵溫度有利于乙醇的收集亦可防止染向了產(chǎn)乙醇方向。菌;且三菌株各具特點,具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值x數(shù)如生0wma門H中國煤化江題發(fā)重組菌BO8( pBBR-PA)、B0( pHY-PA)分別合了在該菌株中分別引人pd基因和/或ahB基因成12×103、1.0×10-3(VV)的乙醇。時,重組菌的乙醇發(fā)酵情況。酶活測定和乙醇發(fā)酵微生物學(xué)通報00年34(5試驗結(jié)果說明:在L, plantarum B0080中同時引人方面,若利用本研究所構(gòu)建的重組乳桿菌進行乳制基因pde、adhB最有效地將碳代謝流導(dǎo)向了產(chǎn)乙醇品單一菌種發(fā)酵,產(chǎn)生的乙醇有利于改善乳品的口方向。菌株L. amylovora B11于1981年由感,不至于掩蓋乳酸菌發(fā)酵的風味,又能刺激腸胃Nakamura報道,能夠利用多種碳源且具有生淀粉蠕動,促進新陳代謝。降解能力;菌株L. acidophilus BO68能夠適應(yīng)酸性參考文獻的培養(yǎng)環(huán)境,其最適生長pH為45,自身代謝產(chǎn)生的乳酸不易抑制菌體生長,且較低的pH環(huán)境有利1] Narendranath n v,HwsH, Thomas k c,aal, Appl Environ于該菌株的純培養(yǎng)不易染其他雜菌。將pde基因和uhB基因同時引人上述兩菌株:檢測到的乙醇為2 I Kelly AS,TmDL., J Ind Microbiol Biotech,0,.32:401原始菌的2倍。我們還考察了重組菌L. amylotorus[3]楊具田草與畜,19%,1:37-39B0( pHY-PA)直接利用4%玉米淀粉合成乙醇的[4]劉振民,駱承庳,食品工業(yè),20,1:21-23情況:發(fā)酵終了能檢測到0.083%(VV)的乙醇產(chǎn)[S]李華,丘文,周廣祥.中國奶牛,00,1:3-5出,而原始菌B0112僅產(chǎn)生0.6×103(WV)乙醇。[6】孫金風,徐敏,張峰,等.撒生物學(xué)報,2004,4(5):600本研究還發(fā)現(xiàn),重組菌的丙酮酸代謝主要還是[7] Nakamura L K. Int J Syst Bacteriol,1981,31:56-63流向產(chǎn)乳酸途徑我們正進一步設(shè)計,在引入pd和[8]Sambrook J, Fritscb E, Maniatis T. Molecular Cloning: a LaboratoryadhB基因的同時,利用同源重組敲除乳酸脫氫酶Manual, 2 Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Prese基因,打斷乳桿菌中由丙酮酸代謝產(chǎn)生乳酸這一主流代謝途徑,以期獲得乙醇高產(chǎn)重組乳桿菌。另一[9] Tompson K, Collins ma. J Microbiol Methode,9,26:73-7新書推介科學(xué)出版社生命科學(xué)編輯部新書推介精編蛋白質(zhì)科學(xué)實驗指南( Short protocols in Protein science)[美]J.E.科里根等編李慎濤等譯978703-0180860定價:120.002006年12月出版本書是《最新蛋白質(zhì)科學(xué)實驗指南》( Current Protocols in Protein Science;CPPS)一書的精編版本,內(nèi)容全部取材于該書和每季度更新的服務(wù)手冊,其詳細提供了多種實驗方案,并包含實驗材料、步驟和每種技術(shù)的參考文獻等信息,可使有經(jīng)驗的研究人員將其作為獨立的實驗室指南來使用。由于蛋白質(zhì)具有多樣性,其分析也必須包括很廣范圍的結(jié)構(gòu)和理化方法,因此每個研究人員都必須盡可能多的同時掌握最新方法和傳統(tǒng)方法。本指南中既包括特定的詳細方案,也包括使方法適應(yīng)手頭特定項目的策略能夠幫助讀者進一步深人進行蛋白質(zhì)科學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的研究。歡迎各界人士郵購科學(xué)出版社各類圖書(免郵費)郵購地址:100717北京東黃城根北街16號計科學(xué)分計聯(lián)系人:阮芯聯(lián)系電話:0106中國煤化工更多精彩圖書請登陸網(wǎng)站htp:!/w. lifesCNMHG