酒科技2004年第5期(總第125期)Liquor-making Science TechnologyNo.52004Tol125半纖維素發(fā)酵生產燃料乙醇的研究進展張宇昊,王頡,張偉,李長文,馬良,周威(河北農業(yè)大學食品科技學院河北保定071001)摘要:將半纖維素轉化成燃料酒精時,必須先轉化成小分子的半纖維素糖,之后發(fā)酵成酒精。預處理是關健工藝酶解前用CO3爆破法對纖維物質進行預處理效果很好;酶解前用稀酸預處理可將半纖維素和淀粉轉化為單糖,而剩余的纖維素成分可用纖維素酶將其水解為小分子糖,該法是一種很好的將玉米纖維轉化為可發(fā)酵糖的工藝。應用代謝工程作為工具選育一些藺株,可有效而經濟地將半纖維素水解液中的各類糖類轉變?yōu)橛杏玫漠a物。(陶然)關鍵詞:燃料乙醇;半纖維素;預處理;半纖維素水解糖中圖分類號:Ts2622;TS2614文獻標識碼:B文章編號:0019286(20405-002203Research Progress of Hemicellulose Fermentation to Produce Fuel AlcoholZHANG Yu-hao, WANG Jie and ZHANG Wei et al.(Food Science Technology College of Hebei Agriculture University, Baoding, Hebei 071001, China)Abstract: Before the conversion of hemicellulose into fuel alcohol, hemicellulose must firstly be converted into micromolecule hemicellu-lose sugar and then into alcohol through fermentation. During the conversion, pretreatment was a key technique. CO, blasting methodapplied in pretreatment before enzymolysis could achieve satisfactory effects. Diluted acid pretreatment before enzymolysis could converthemicellulose and amylum into monose, and the residual cellulose components could be hydrolyzed into micromolecule sugar by cellelase. It proved a good technique for the conversion of corn cellulose into fermentable sugar. And some strains developed by the meanof metaboly work could effectively and economically convert varieties of sugar in hemicellulose digest into useful product. (Tran. byYUE Yang)Key words: fuel alcohol; hemicellulose; pretreatment; hemicellulose hydrolyzed sugar在自然界中普遍存在的木質纖維素( lignocellulosic materi-醛酸叩。米糠中性木聚糖包括46%的木糖,4.9%的阿拉伯糖6.als),主要由纖維素、半纖維素和木質素組成,這些物質是陸生植%的半乳糖,19%的葡萄糖和11%的脫水糖醛酸。小麥阿拉伯木物細胞璧的主要組分。半纖維素較集中于初級和次級細胞壁中,與聚糖包括658%的木糖,335%的阿拉伯糖,0.1%的甘露糖0.1木質素和纖維素結合在一起,以增強細胞壁的強度"。%的半乳糖和03%的葡萄糖。玉米纖維木聚糖是一種包含B-1近年來,半纖維素由于其在工農業(yè)的實際應用而受到重視,其4鍵合木糖殘基的復雜異質木聚糖,包括48%-54%的木糖,33%中半纖維素物質因其可高效地轉化成燃料酒精而備受關注。在半35%的阿拉伯糖,5%-11%的半乳糖和3%-6%的葡萄糖醛酸纖維素轉化成燃料酒精時,其必須先轉化成小分子的半纖維素糖,四。之后再發(fā)酵成酒精。本文對半纖維素的結構及其糖化發(fā)酵的方法2半纖維素的預處理做一介紹。纖維物質包括不同的農業(yè)廢棄物(秸稈殼、莖、桿)、落葉和松1半纖維素的結構木、城市廢物及工廠的紙漿廢物、草本農作物。這些物質的組成不半纖維素是戊糖(木糖、阿拉伯糖)、己糖(甘露糖、葡萄糖、半同,主要組分是纖維素(20%-35%),其次是半纖維素(20%-35乳糖)和糖酸所組成的不均一聚糖,為異質多糖,結構與纖維素不%)和木質素(10%-25%)。蛋白質、油脂和灰分是土壤纖維物質同硬木半纖維素中含有較多的木聚糖,但軟木半纖維素中則含有的其他組成成分叫。表1列出了部分纖維物質的主要組成。這些物較多的葡甘露聚糖凹。質的結構非常復雜,而且本身的組成對酶解具有一定的抗性。在一木聚糖是含量最多的一類半纖維素叫。木聚糖被分為線性同般纖維物質的結構模式中,纖維素纖維被鑲嵌在一個木質多糖的型木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、葡萄糖醛木聚糖和葡萄糖醛阿拉伯矩陣中。木聚糖在以共價鍵和非共價鍵聯(lián)結的完整細胞壁中起著糖基木聚糖十分重要的作用大約80%的木聚糖主鏈含有側鏈,阿拉伯糖和葡萄糖醛酸的纖維素物質的預處理是酶解的關鍵。預處理主要包括粉碎、溶單體側鏈及包含阿拉伯糖、木糖及半乳糖殘基的寡聚側鏈分別鍵解、水解和分離纖維素、半纖維素和木質素組分。這些方法包括濃合于主鏈D-木糖殘基的C-3和C-2位置上。不同源的木聚糖,酸、稀dYH中國煤化工爆破、潮濕-氧化、石灰處如草、谷類、軟木和硬木其組成上都有所不同。樺樹木木聚糖包括理、熱在每種處理中,原物質893%的木糖,1%的阿拉伯糖,14%的葡萄糖和83%的脫水糖的體CNMHG稀酸預處理有兩種方法收稿日期:2003-12-22;修回日期:2004-05-28作者簡介:張宇吳(1978-),男,在讀碩士研究生004年第5期(總第125期)釀酒技No.52004To.125r-making Science Technology部分纖維素物質的組成3半纖維索的酶解多糖組分(%)木聚糖的全部生物降解需要內切型β-1,4-木聚糖酶和外切纖維素半纖維素米纖維型β-木糖苷酶及幾種輔酶,例如:a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶,a-葡米穗軸玉米秸稈550500535萄糖苷酶醋酸木聚糖酯酶和P-香豆酸酯酶。這些酶對于各種木572052聚糖的水解都是必要的。內切型β-1,4-木聚糖酶從β-1,4-木聚25糖主鏈的內部切割木糖苷鍵,使木聚糖降解為木寡糖,外切型β-木糖苷酶通過切割木寡糖的末端而釋放木糖殘基。α-L阿拉伯柳枝稷呋喃糖苷酶和α-葡萄糖苷酶可從木聚糖主鏈上移除阿拉伯糖和百慕大海岸草4-0-甲基葡萄糖酸。酯酶可水解連在木聚糖木糖單元和醋酸(醋對于較少的固體量(5%-10%,w/w)采取高溫(>160℃)連續(xù)流程酸木聚糖酯酶)之間或阿拉伯糖側鏈殘基和酚酸之間的酯。法,對于較多的固體量(10%40%)采取低溫烘烤過程阿。高溫下許多微生物有可以完全降解木聚糖的酶系,例如:青霉菌的稀酸處理通常把半纖維素處理成可用性糖(木糖、阿拉伯糖和其( Penicillium capsulatum)和( Talaromyces emersonii)a。 Bachmann他糖)。剩余物包括纖維素和其他木質素。木質素可以被一些溶劑和 McCarthy報道了嗜熱放線菌類( Thermomonospora fusca)中的(如乙醇,丁醇,乙酸)浸提。含木質素的纖維素可水解成水溶性糖內切型β-1,4-木聚糖酶、外切型β-木糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃和不可溶的殘渣,即木質素和一些未反應物。在蒸汽處理中,SO2糖苷酶和醋酸木聚糖酯酶間有很顯著的協(xié)同作用。而以醋酸木聚可作為一種催化劑使纖維素酶解得更加徹底,并提高半纖維素水糖作為底物的酶解證明了主鏈的解聚與側鏈的裂解之間的協(xié)同作解糖的回收總量。對于柳木的蒸汽處理,溫度在200-210℃并添用。許多木糖酶無法分解側鏈處的木糖單元。要想使木聚糖主鏈加1%w/w)的SO2是最佳條件。以柳木中的可利用多聚糖計算,葡被完全水解就必須使其側鏈也被裂解。另一方面,幾種輔酶也只能萄糖產量可達理論值的95%。利用蒸汽降解半纖維素的方法通常裂解木聚多糖的側鏈,只有木聚糖被部分水解這些酶才能去裂解包括高溫短時(270℃,1min)和低溫長時(190℃,10min)y。Mor-其側鏈。總之,雖然木聚糖結構比纖維素復雜,且需幾種具有不ano和Cray報道說,100g甘蔗渣在加入1%硫酸且水體=21同特異性的酶才能完全水解,但木聚糖的多糖不形成類似纖維素的情況下在220℃進行蒸汽爆破,之后進行酶解,可產生651g蔗的晶狀結構,因此相對來說木聚糖更容易被酶水解玉米纖維是玉米濕磨后的一種副產物,包括20%淀粉,15%酶解前用CO2爆破的方法對纖維物質進行預處理效果很好。纖維素和35%的半纖維素嗎。Saha和 Boyhast評估了為使玉米纖eng比較了用CO2蒸汽爆破和氨爆破對甘蔗渣預處理的效果,維素中的淀粉、纖維素、半纖維素轉化為可發(fā)酵糖的幾種預處理方發(fā)現(xiàn)CO預處理的效果要好于氨處理的效果,且CO2爆破的過程法及其轉化的程序預處理方法包括熱水處理、堿處理、稀酸處理中不會產生阻礙水解的物質。CaoP報道了一種預處理的方法,為熱水預處理(12l℃,1h)有利于淀粉和纖維素的酶解,但不利于半了分離出木質素、醋酸鹽和一些浸提物,將纖維物質(以玉米穗軸纖維素的酶解。用堿進行預處理(10:1,w/w,121℃,3h)半纖維素作為給料)在環(huán)境溫度下浸泡在稀的NHOH中一段時間,之后用酶也無法完全水解玉米纖維中的半纖維素。用稀酸預處理可將半稀酸處理即可輕易地將半纖維素水解為小分子糖,纖維素的殘渣纖維素和淀粉轉化為單糖,而剩余的纖維素成分可用纖維素酶將則可被酶解為葡萄糖。 Kurakake用氨水預處理甘蔗渣秸稈和柳其水解為小分子糖。此過程為玉米纖維(15%固體,w/v)加入稀酸枝稷以提高其酶解效果。濕氧法可使纖維物質轉變?yōu)椴糠挚扇艿?0·5%HSO,vv)于121℃lh,中和至pH5.0之后將預處理過的半纖維素水解糖和部分不溶的纖維素,而纖維素部分則可被輕易玉米纖維用纖維素酶和β-葡萄糖苷酶處理。此處理后的單節(jié)顯性地轉化為酶解多糖。 Bjerre發(fā)現(xiàn)堿和濕氧法聯(lián)合不會產生糠醛糖的產量可達理論值的85%-100%,且這一過程不產生類似于糠5-羥甲基糠醛等阻礙水解的物質。 Klingel概括了堿性濕氧法處理醛等的發(fā)酵抑制物。因此,是一種很好的將玉米纖維轉化為可發(fā)酵麥秸的降解產物,從CO2和水、羧酸中分離出的是半纖維素和木糖的工藝。質素的降解產物?？刂茰囟燃皦A的添加量可把芳香醛的形成率降Leathers和Gupa描述了用一種從 Aureobasidium sp中制成到最低。表2列舉了纖維素物質的處理方法。的粗酶制劑使玉米纖維水解的過程,結果顯示這種粗酶制劑只能土壤纖維素物質的處理方法部分水解其中的木聚糖。Saha從132個腐木和腐爛秸稈旁的土樣中分離出了3株真菌,都有將玉米纖維中的木聚糖當作底物生長熱-機械法熱磨、熱剪、熱壓的能力,即從此3株菌中制得的粗酶制劑可很好地降解玉米纖維自動水解法蒸汽加壓、蒸汽爆破、二氧化碳爆破酸處理稀酸處理、濃酸處理中的木聚糖。但從兩株菌中分出的內切-木聚糖酶卻無法降解玉氨法、堿濕氧法米纖維木聚糖,而分離出的純的β-木糖苷酶則可從短鏈木聚多糖有機溶劑處理甲醇處理、乙醇處理、丁醇處理中釋放木糖殘基。由此可見,為了高效地水解木聚糖底物,將內些來自木質素降解的芳香化合物,來自糖降解的呋嘯衍生切-木聚糖酶與幾種輔酶聯(lián)合使用是必要的。另外B-木糖苷酶則物和一些脂肪酸被認為是處理纖維物質過程中產生的阻礙物叫,可被一些木糖抑制,因此為了使以木聚糖轉化為酶解多糖可以商為了將這一影響降至最小,人們做了很多研究其中包括離子交換業(yè)化,提高R有的木糖酎受件也是必要的。樹脂法、用木霉屬( trichoderma)的絲狀真菌預處理、不揮發(fā)復合物4由半中國煤化工的去除、醚或烷基醋酸鹽的浸提堿或醋酸鈉的處理。 Persson在CNMH和效率,半纖維素糖的用面包酵母發(fā)酵經稀酸處理過的云杉前,用逆流超臨界萃取的辦利用十分重要在2002年,酒精產量超過2億加侖,主要是以玉米法為之“解毒”。淀粉為原料生產的。燃料酒精一直被期望能成為一種低成本的清釀酒翻技2004年第5期(總第125期)Liquor-making Science TechnologyNo.52004Tol.125潔燃料而取代汽油現(xiàn)階段汽油中添加MTBE( methyl tertiary bully段的快速發(fā)展,可得到更多產乙醇的基因工程菌。通過代謝工程手ether)以提高汽油的清潔性,但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)MTBE對地下水有污染叫。段增加或修飾一些特點,例如乙醇或阻遇子忍耐性的增加,半纖維水和未被充分利用的纖維素物質成了生產燃料酒精的低成本素的水解及耐熱性提高及對營養(yǎng)需求的進一步減少,對糖的代謝原料。半纖維素經預處理和酶解后都會產生混合糖混合糖根據(jù)來能力的進一步改進,可獲得具有樂觀前景的工業(yè)菌株,但還需要改源的不同包括木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、海藻糖和鼠李糖。進發(fā)酵過程中的工藝過程。盡管傳統(tǒng)的釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)和絮凝性細菌參考文獻:(2 momonas mobilis)可輕易將葡萄糖發(fā)酵為乙醇,但卻不能將木[1]孫迅,王宜磊,鄧振旭半纖維素生物轉化研究進展[]微生物學雜糖和阿拉伯糖發(fā)酵為乙醇。酵母( Pachysolen tannophilus)、畢赤酵志,1997,17(1):50-55母( Pichia stipiti)和假絲酵母( Candida shehate)具有將木糖發(fā)酵(2] Badal c sah; Hemicellulose bioconversion(. J Ind Microbiol為乙醇的能力。但這些酵母如用于商業(yè)生產燃料乙醇卻有諸多Biotechnol2003,30:279-291的弊端,如:它們的乙醇耐受力低,發(fā)酵率較慢及發(fā)酵過程中供氧[3]鄔義明,等植物纖維化學[M]北京:輕工業(yè)出版社,1991不好控制,另外還有它們對纖維素底物的水解和預處理過程中產[4]EdS, Ohnishi A Kato K. Xylan isolated from the stalk o生的阻礙物敏感凹。木糖盡管可以用糖異構酶轉化為傳統(tǒng)酵母可Nicotiana tabacum[J]. Agric Biol Chem, 1976, 40:359-364.發(fā)酵的木酮糖,但其成本較高。而其他一些戊糖如阿拉伯糖等幾s] Saulnier L marot C, Chanliaud E, Thibault JF. Cell wall polysac-乎沒有自然存在的酵母可以發(fā)酵。charide interactions in maize bran[J]. Carbohydr Polymers, 1995, 26些細菌可利用這些混合糖。例如:大腸桿菌( Escherichia279-287col)克雷伯菌( Klebsiella歐文氏菌Enna)、乳桿菌( LLactobacil[6] Shibuya N, masaki t. Structural features of rice branlus)細菌( Bacillus)、梭狀桿菌( Clostridia)等。但它們只能產生少量的hemicellulose[J]. Phytochemistry, 1985, 24: 285-289乙醇而產生的大部分都是一些混合酸和有機溶劑因此我們可以7] Doner LW, Hicks KB. Isolation of hemicellulose from corm fiberby alkaline hydrogen peroxide extraction [J]. Cereal Chem, 1997,采用細菌、酵母重組菌,通過代謝工程來發(fā)酵纖維素物質以生產燃74:176-181料乙醇。代謝工程指直接采用重組DNA技術對菌株進行改進,如(8] Thomson JA. Molecular biology of xylan degradation[J.FNs引入特殊的基因修飾(修飾基因的啟動子)進行基因的刪除或導Microbiol Rev. 1993. 104: 65入新的基因或途徑到細胞中去,以改變細胞的產物或改善細胞的(9)SunY, Cheng J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol性能。它也稱途徑工程嗎。production[J]. a review. Bioresour Technol, 83:1-I1.一些基因包括大腸桿菌的K011,SL40,FBR3及絮凝性細菌[10] Duff SJB, Murray WD. Bioconversion of forest products industry的CP4p2B5和酵母屬的140(LNH32)等被重組后發(fā)酵玉米纖維waste cellulosics to fuel ethanol[J]. a review. Bioresour Techno水解糖,結果顯示其可在玉米纖維發(fā)酵糖濃度在21-34g/L的范圍內將之轉化為乙醇產量為041-0.5g乙醇/g糖。最近 Nichols] Bjerre AB. Olesen AB,, Enqvist, Ploger A. Pretreatment of將葡萄糖磷酸轉移酶(PsG)的基因導人到大腸桿菌中,使之可以wheat straw using combined wet oxidation and alkaline hydrolysis同時發(fā)酵葡萄糖、木糖、阿拉伯糖的混合糖,乙醇產量可達理論值resulting in convertible cellulose and hemicellulose[J].Bioresour的87%-94%。 Martinez報道通過啟動子取代和使用多拷貝基因Technol,199649568-577可增加基因表達,即可消除導入乙醇基因后的大腸桿菌對高濃度12】 Bachmann SL, McCauthy AJ. Purification and cooperative activityof enzymes constituting the xylan-degrading system of Thermom-復雜營養(yǎng)物的需要。大腸桿菌經基因重組后對乙醇的忍耐力有所onospora fusca[J]. Appl Environ Microbiol, 1991, 57: 2121-2130.提高可耐受6%的乙醇。重組的絮凝性細菌被導人了4種基(3 Saha BC, Bothast R. Fuel ethanol production from com fiber因,分別為大腸桿菌[xyA( xylose isomerase)、xylB( xylulokinase)、alcal prospects[J]. Appl Biochemtransketolase), tktA( transketolase),可以木糖為唯一碳源生產乙醇Biotechnol1998,72115-125.產量可達理論值的86%。Deng和Ho證明了磷酸化是通過戊[14] Saha BC. Bothast RI. Pretreatment and enzymatic saccharification糖磷酸途徑代謝木糖的重要一步。來自于釀酒酵母的XKS基因of corn fiber[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 76: 65-77.和來自畢赤酵母的XYL和XYL2的一種基因被導入一個混合主15]謝麗萍,王正祥諸葛健利用可再生資源生產酒精的細菌、酵母中體當中,此混合主體是通過 Saccharomyces ubarum和糖化酵母的代謝工程[]食品與發(fā)酵工業(yè),27(12):63-68.c)的傳統(tǒng)育種獲得的這一重組產生了61ms聊pb母屬( Saccharomyces)的pLNH32基因,其可在以木糖為唯一碳源的環(huán)境中生長井產生乙醇。ethanol production[J]. J and Microbiol, 1998, 20: 132-138盡管用微生物發(fā)酵半纖維素生產乙醇仍存在一些障礙,但世17hmgM,EdyC. Deanda K, Finkelstein M. Metabolic]engineeing of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas界的各個研究小組在不斷地努力,應用代謝工程作為工具選育出mobilis[J ]. Science, 1995, 267: 240-243一些菌株,可有效而經濟地將半纖維素水解液中的各類糖類轉變18 Deng Xx, Ho NWY. Xylulokinase activity in various yeasts incl為有用的產物。最近的大部分研究集中在絮凝性細菌( AmabilisSaccharomyces cerevisiae containing the cloned xylulokinas大腸桿菌(E.col)、釀酒酵母( S cerecisiae)上。、隨著基因工程研究手中國煤化工905:19319CNMHG歡迎訂閱《釀酒科技》