203年第23卷有機化學小. 23. 2003第12期，1340~ 1347Chinese Joursal of Ongaunic ChemistryNO. 12, 1340- 1347●綜述與進展●蛋白質和肽類分子的聚乙二醇化化學姜忠義*許松偉王艷強(天津大學化工學院天津3002)摘要蛋白質和肽類生物大分 子聚乙二醇化后,溶解行為改善,穩(wěn)定性增強,免疫原性消除 或降低,循環(huán) 半衰期延長,藥物動力學優(yōu)化,因而在生物技術和生物醫(yī)學中具有重要的應用前最.聚乙二醇化也逐漸發(fā)展成為一種平臺技術 .隨著聚乙二醇化蛋白質和肽類進入臨床試驗階段.聚乙二醇化化學越米越引起研究者的重視簡要評述第一一代和第二代聚乙二醇化化學,主要包括聚乙二醇化學修飾劑的類型與性能比較等.關鍵詞蛋白質,肽類. 聚乙二醇化，化學Chemistry for Pegylation of Protein and Peptide MoleculesJLANG, Zhong-Yi"XU, Song-WeiWANG, Yan-Qiang( School of Chemical Enginering and Tehnology，Tanin Unitesit，Taryin 30072)Abstract The pegylated proteins and peptides have found promising applications in biotechnological and bionedicalfields due to the improved solubility, themal and mechanical stabilty, reduced antigenicity and immunogenicity ，enhanced circulating half-lives， optimized pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Consequently,pegylation gadually becomes a platfrm technology . The importance of chemistry of protein and peptide pegylation hasattracted more and more atentions as more PEC conjugates have reached late phase clinical trials. In this paper, thefirst-generation and second- generation pegylation chermistry is briely reviewed, mainly including the diferent types ofPEG chemical modifers and their performance comparison.Keywords protein, peptide, pegylation, chemistry蛋白質和肽類分子的化學修飾已經成為生物技術與生于第二代PEG化化學的聚乙二醇修飾劑正在得到越來越廣物醫(yī)學領域的研究熱點,而聚乙二醇(Palycthylenegyol，泛的應用[31.PEG)則是應用最為廣泛的大分子修飾劑之一- 20 世紀70年本文簡要綜述了第一代和第二代PEC化化學,重點介代,Davis首先對蛋白質的PEC化學修飾(又稱聚乙二二醇化，紹 了用于蛋白質和肽類分子化學修飾的各種PEG衍生物及PEG化)進行了開拓性研究川.PEC化學修飾實際上.就是在其性能比較.生物活性分子表面共價連接上親水性PFG長鏈.蛋白質或肽類分子PEG化后,其主要的生物學和生理學功能保持不1 PEG 的特性變,而可同時獲得一些非常期望的性質(2].隨著越來越多的PEG-蛋白質偶聯(lián)物投人到臨床應用階段,人們逐漸認識到PEG化化學在修飾反應中的重要性.現(xiàn).PEG最常見的形式是以羥基為末端的線性或枝狀聚在已經上市的一些PEG-蛋白質偶聯(lián)物如Adagen'，醚,其化學通式為:Oncopar , PEG-Intron'等,均是基于第-代PEG化化學制備出來的,其特征是:(1)修飾劑的分子最- -般都很低;(2)雙官HO(CH2CH20)2CH2CH2OH能團聚乙二醇雜質容易引起交聯(lián)和團聚;(3)連接鍵的水解穩(wěn)定性差;(4)選擇性低和副反應存在.為解決上述弊端,基PEG通常呈電中性,易溶于水和許多有機溶劑如乙醇、中國煤化工曲E-mail: zyjing@ tju. edu. cn; Fax: 022-27404066.Racrived Seperdber 20, 2002; rerised March 21, 2003; accepted April 16, 2003 .MYHCNMHGNo. 12姜忠義等:蛋白質和肽類分子的聚乙_醇化化學1341二甲苯、丙酮和氯仿中;PEG的分子最選擇余地大,從幾百到- 一個氯化物同時生成了一一個帶有殘留仲胺的連接 剩下的氯幾萬.用于生物醫(yī)學的PEG的分子量通常在幾百到2000之原子與親核殘基反應活性則低得多,但仍叮使含親核殘基的間;分子量超過10000 的PEG通常尤毒，且已通過FDA認證蛋白質之間發(fā)生 交聯(lián)反應為了解決這一問題,nada等合可用于藥物、食品和化妝品;在水溶液中,PEG為高度水合的成了2,4-雙鏈甲氧基PEG-6-氯乙烯三嗪(mPEG2-三氯嗪).聚合物，每個乙氧基單元可以結合2~3個分子水.由于骨架氯原子的低反應活性決定了它只能特異性地與賴氨酸和半的靈活性以及與水分子的結合,PEG分子水力學半徑較大，胱氨酸殘基反應,而不會引起其他一些副反應.其表觀體積為相近分子量的水溶性蛋白質分子體積的5到另一種能夠與多種氨基酸發(fā)生非特異性反應而以仲胺10倍左右(4.51 ,形式連接到蛋白質、病毒以及脂質體上的烷基化試劑是PEG為避免在修飾過程中發(fā)生交聯(lián)和團聚,通常采用甲氧基三氟乙基磺酸酯.雖然它對某些氨基的專一性比PEG二氯聚乙二醇(mPEG)作為修飾劑的合成原料,其化學通式為:三嗪好,產物中無連接臂的殘留,但是偶合反應的機理存在爭議,偶聯(lián)物并不唯-且具有不確定性. Gais等|9)已經發(fā)現(xiàn)CHzO(CHCH20),CH2CH20HPEG三氟乙基磺酸酯偶合到小分子氨基上可以產生-種含有可降解磺胺酯連接的產物，這樣就會造成PEG與蛋白質制備工藝不同,來源不同，mPEG的分散性大小有很大的偶聯(lián)物中含有一些降解產物.差別.mPEG的分散性大,所制備的修飾劑的分散性也大,修大多數(shù)第- -代PEC化學是那些通過烷基化得到的偶聯(lián)飾劑與蛋白質或肽類分子形成的偶聯(lián)物(以下簡稱偶聯(lián)物)物.兩種用途最廣的第一-代 PEG修飾劑是mPEG的琥珀酰亞的分敬性也相應增大,偶聯(lián)物的均一性難以保證.胺碳酸酯(SC-PEG)和苯并三唑碳酸酯( BTC PEG)I11.雖然另外,由于聚合過程中少量水的存在, mPEG產品中總這兩種術生物可以優(yōu)先與賴氨酸殘基反應形成碳酸酯鍵,但會有1%- 15%的PEG二醇雜質.二醇含量與mPEG的分子也可與組氨酸和酪氨酸殘基反應.SC-PEC比BTC-PEG的穩(wěn)量大小有關, mPEG分子量越小，則二醇含量越低.二醇在定性要好一些,25 C,pH值為8.0時前者的半衰期為20.4mPEG的活化過程中會形成不期望的交聯(lián)或團聚.min,后者為13.5 min.其他可以和蛋白質形成脲烷鍵連接的PEG烷基化試劑2 PEG 化化學包括硝基苯碳酸酯(圖1pNPC-PEG),三氯苯碳酸酯(TCP-PEG)以及碳酰咪唑(CD-PEG)[12? .這些試劑是通過mPEG末為把PEG偶聯(lián)到蛋白質或多肽鏈上，首先須將PEG末端的羥基與氯甲酸酯或碳酰瞇唑反應獲得的.這些衍生物的端的羥基轉化成高反應活性的官能團.如活潑酯、醛基、酰肼反應活性比前述的SC-PEG以及BIC-PEG低.通常,衍生物等.官能團的選擇取決于被修飾分子上能修飾的基團類的反應活性越低，修飾專-性越好.第一代PEG衍生物還有琥珀酰亞胺琥珀酸酯(3](SS-型[6!.蛋白質或肽類分子上的反應性官能團多呈親核性,其親.PEG).首先mPEG與琥珀酸酐反應,然后將羧酸活化成為琥核活性通常按下列順序依次遞減:巰基> a-氨基>ε-氨基>珀酰亞胺酯就可以制備出SS-PEG.聚合物骨架中含有與蛋羧基>羥基.巰基通常存在于蛋白質的二硫鍵和活性位點白質反應后留下的第二個酯鍵.該鍵在衍生物和蛋白質偶合上.而羧基若不與蛋白質上的氨基發(fā)生分子間或分子內中和以后非常容易水解斷裂.這不僅僅使這種衍生物失去了作為反應，也很難活化.因此,蛋白質或多肽分子最容易與修飾劑修飾劑的優(yōu)勢,而且水解之后留在蛋白質上的琥珀酸末端可發(fā)生作用的位點是分子表面賴氨酸殘基上的氨基,包括a- .以成為半抗原,誘發(fā)蛋白質的免疫原性.合成第-代PEG衍生物還可通過PEG和一個能與羥基氨基、e-氨基.反應的基團(包括酸酐、氯化物、氯甲酸酯以及碳酸酯)之間2.1第一代PEG 化學的反應.2.1.1與氨基偶聯(lián)的 PEG化化學PEG化通常要在溫和條件下進行.對于蛋白質或肽類分由于具有較高分子量的PEG中二醇雜質所占的比率往子,常常參與反應的基團為a-和ε-氨基.圖1中列出了用于往高達15% ,所以第一代PEG衍生物對于蛋白質修飾并不蛋白質或肽類分子中的a-或ε氨基PEG化的第- -代PEC衍是非常理想.生物[6],包括:(a) PEG二氯三嗪衍生物,(b) PEG三氟乙基2.2 第二代PEG化化學磺酸酯,(e) PEG琥珀酰亞胺碳酸酯,(d) PEG苯并三唑碳酸2.2.1與氨基偶聯(lián)的 PEG化化學依據(jù)第二代PEG化化學設計出的PEG衍生物可以較為酯,(e) PEG對硝基苯碳酸酯,(f) PEG三氯苯碳酸酯,(g)有效地解決第-一代PEG衍生物作為化學修飾劑存在的-些PEG碳酰咪唑以及(h) PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯.Davis等工在初期是用氰尿酰氯(三氯均氰,三聚氰酸問題，如二醇雜質存在、僅局限于低分子量mPEG、連接鍵不氣)法活化的PEG來制備蛋白質的修飾劑.PEG的這種二氯穩(wěn)定、副反應多、選擇性差等.第二代PEG衍生物的第一個; mPEC-乙醛更易制備和.三嗪衍生物可以和多種親核基團反應,經過修飾后它取代了中國煤化工MHCNMHG1342有機化學Vol.23. 2003OPEG-0-C- 0-CH2CH2-0-C -NI-RPEG-NH-RPEG-0-C-0-NNH-RPEG-0-PEG-OHPEG-0- <~O-PEG^NH-R .PEGPEG-0-C-0-al PFG-0-C-NH-Rcl圖1第一代修飾氨基的 PEG術生物Flgure 1 Firsl-generation PEG derivatives for arnine conjugation使用. Kinstler等[15,.6]在進行G-CSF 等的PEG化時發(fā)現(xiàn)了mPEG -0CH2CH.CH(OCH2CH)2PEG-丙醒的一個重要特性,就是在酸性條件下(pH=5),醛與a~氨基的偶合具有高選擇性,這是由于a-氨基與其他親核類基團相比具有較低的pK。值.親電類PEG衍生物與氨mPEG- . OCH2CI2CH(OH)2mPEG-OCH2CH-CII基酸殘基的偶合在很大程度上取決于氨基酸殘基的親核性.親核反應只有在蛋白質水溶液的pH值接近或略高于蛋白質的pK。值時才會發(fā)生,所以每個殘基的反應活性還取決于相鄰的氨基酸殘基.雖然選擇性仍達不到100%,但是修飾OH2°劑與賴氨酸反應的不均- -性大犬降低.通過SchifT堿的形成mPEG- -OCH2CH2CHOH二mPEG-OCH2CH2CHOH + H2O醛可以偶聯(lián)到伯胺上,從而得到穩(wěn)定的仲胺(圖2).與其它親電活性基團不同,醛基只與伯膠反應.只是Shiff堿的形成圄3用于還原性胺化的 PEG醛類水合物的原位生成較為緩慢,容易引起生物分子的失活.需要說明的是,pH值Fgure3 Insiu genenation of PEC- lekyde hydratre wed for rduetve對選擇性有顯薯的影響,在堿性介質中丙醛基比乙醛基更為amination穩(wěn)定.mPEG-O(CH2)- -C- -0- -NN-RmPEG- 0CH2CHCH + NH-R縮合、mPEG -OCH2CH2CH還原。mPEC-0CH)CH:CHNH- R團2用PEG丙醛進行還原性胺化mPEG-0(CH2),CH-C- -0- -NFigure 2 Reductive amination by PEG-propiondehyde另一種利用PEG-醛術生物的方式是PEG-丙醒或PEG-乙醛通過酸水解形成的乙縮醛水合物17.8)(圖3) .其優(yōu)點在于圖4由PEG丙酸和T酸制備的線形PEGNHS酯(1)和由PEG偶聯(lián)物的儲存穩(wěn)定性好、純度高.化學修飾中使用最多的烷丙酸和丁酸制備的叉形PEG NHS酯(2)基化試劑是PEG羧酸酯.它可與氨基在接近體內環(huán)境的條Figure4 Linear PEG NHS esters (1) derived from propionic and件下反應,形成穩(wěn)定的酰胺鍵,如圖4所示，將PEG-羧酸中butanoic acids, and a-branched PEG NHS esters (2) derived from間產物和N_羥基琥珀酰亞胺以及碳二亞胺反應，可以得到propionic and butanoic acidsPEC-琥珀酸活性酯.中國煤化工MHCNMHGNo.12姜忠義等:蛋白質和肽類分子的聚乙二醇化化學1343分子骨架中不含有易降解鍵的第-種 PEC羧酸衍生物緩慢反應形成穩(wěn)定的硫醚鍵.在反應時PEG-IA要過量,同時為羧甲基PEG(CM-PEG)[19],但它過于活潑(在25 C下,pH反應要避光進行,以避免產生游離的碘而與氨基酸反應.將值為8時的水解半衰期為0.75min),難以使用.Harris等制PEG化的半胱氨酸用羥酸水解后,產生的羧甲基半胱氨酸是備了PEG的酯類衍生物,在活潑酯(C0OSu)和PEG最后- -個一種穩(wěn)定的衍生物,可通過標準氨基酸分析鑒定和定量.正CH2CHO單元之間有一條連接臂,連接臂的長短對反應活性吡啶基二硫化物- -PEC可以在酸性和堿性條件下與蛋白質和選擇性有很大影響.例如,帶有兩個亞甲基的SBA-PEG,在的巰基反應形成穩(wěn)定的二硫鍵.25心, pH值為8時水解半衰期為23 min.帶有一個亞甲基2.2.3 糖類殘基或N-末端的PEG化化學的SPA-PEG,同樣條件下的水解半衰期為16.5 min. 由于糖類殘基或蘇氨酸及絲氨酸上:的N-末端的氧化是蛋白mPEG-SPA和mPEG-SBA的分子骨架中無酯鍵,所以形成的質進行定點PEC化的另-種方法.糖類可用酶如葡萄糖氧連接鍵較穩(wěn)定,并具有理想的反應活性,另外,PEG活性酯對化酶來氧化,或用高碘酸鈉進行化學氧化產生具有反應活性于氨基和水的反應活性可以通過在羧酸中引人一個a-分支的醛基,這些醛基可與PEG-肼反應生成腙或與PEC-胺反應形分子來降低.生成可逆的Schif堿124.用硼氫甲腈鈉可將腙還原為更穩(wěn)定2.2.2半 胱氨酸殘基的PEG化化學的烷基肼化物,而Schif堿可以還原為仲胺.用PEG-氨基進帶有游離巰基的蛋白質為數(shù)不多.但是,采用基因工程行還原性烷基化存在的主要問題是，蛋白質上的氨基與手段把巰基引入到蛋白質中的特定位點后[20],就可以用對PEG氨基具有相似的反應活性,這樣就有可能形成交聯(lián)聚集巰基呈現(xiàn)一定反應活性的PEGs對該蛋白質進行高選擇性修體.此情況下, PEG-肼化物就更適于使用.雖然在酸性條件下飾.由于蛋白質表面半胱氨酸殘基數(shù)比賴氨酸殘基數(shù)要少得蛋白質的氨基主要呈質子化,但由于PEG肼化物的堿性比多,因此半胱氨酸是一個很好的靶位 ,可以實現(xiàn)特異性修飾.伯胺弱,所以反應的結果是選擇性地形成PEG腙.利用這個此外,利用疏基可進行不同類型的化學修飾.該途徑的潛在方法可以形成多個偶合位點,但修飾位點只對糖類有特異缺點是通過基因工程加人的游離半胱氨酸會增加形成不正性確二硫化物和蛋白質二聚的幾率.代表性的有PEG酰肼( PEG hyraide) .酰肼基團極低的為了半胱氨酸PEG化而研制的PEG衍生物有PEG馬來pK值使得它可以在酸性環(huán)境(pH 4. 5~ 5)中仍可以和羧基酰亞胺乙烯砜、碘代乙酰胺以及正吡啶基二硫化物等(圖結合,而蛋白質中的氨基在該條件下由于發(fā)生質子化而不能5),這些衍生物各有優(yōu)缺點[1-23] . PEC-乙烯砜在中性和弱堿與羧基反應,從而可實現(xiàn)選擇性定位修飾.性時只與巰基緩慢反應形成穩(wěn)定的硫醚鍵,pH升高時,也可另一種定位修飾的途徑是利用蛋白質中絲氨酸和蘇氨與氨基反應,但速度要慢得多.當反應液中有有機溶劑存在酸上的N_末端,這個末端可以用高碘酸氧化轉化為乙醛酸時，,與氨基的副反應也會增加.與PEG-VS不同, PEC-馬來酰衍生物.Gaetned25]等氧化白介素8上的絲氨酸的N-末端形亞胺在酸性條件下易與巰基反應,但在水溶液中不穩(wěn)定,可成乙醛酸衍生物,這種衍生物可以偶合到氧化胺和肼的PEG發(fā)生開環(huán)或加成反應. PEG-碘代乙酰胺通過親核取代與巰基2.2.4可逆修飾的 PEG化化學大多數(shù)PEG化化學的設計是使PEG與蛋白質之間形成S-R穩(wěn)定的連接鍵,以利于偶聯(lián)物的純化和長期保存.但有時mPEG-r mPtEG- -N(I)PEG會占據(jù)或屏蔽蛋白質的活性位點而降低其活性.另外，PEG偶聯(lián)物分子量對于蛋白質的活性有直接影響.分子量越大,則體外活性越低而體內活性越高[26].在研制PEG-IntonmPFG--CH=CH2.R--SHT mPEG- -S- -CH2CH2S-R (2偶聯(lián)物時, Enzon公司用蛋白質和PEG之間可降解的化學鍵改進藥物動力學的半衰期,通過釋放天然的干擾素a-2b來減少活性喪失. PEC-Intron偶聯(lián)物是通過將PEC-SC和干擾素mPEG- NHCCH2I-mPEG- NHCCH2S- -R (3)a-2b在酸性條件下偶合得到的.這樣偶合可以使大量的PEG聚集到組氨酸His34上(圖6).在此情況下,PEG偶合到mPEG-S-S- -mPEG-S-S-R4)組氨酸的咪唑環(huán)上NH的位置上,形成氨基甲酸酯.一段時間后,PEG會從蛋白質上釋放出來.PEG-Intron和樹型PFG-圖5 PEG 巰基衍生物干擾素a-2a (Pegsas)偶聯(lián)物相比前者體外活性較高,后者體(1) PEC馬來院業(yè)胺,(2) PEG乙烯磺酸,(3) PEG碘代乙酰胺,(4)PEC鄰內活性較高(27,2:氮苯基二硫化物另一種通過PEG化使蛋白質活性恢復的途徑是通過酶Figure 5 Thiol reactive PEGs降解、水解或還原將游離的蛋白質釋放出來.首先嘗試的(1) PEG mleinide, (2) PEC vinygl ulore,r (3) PEG idacetanide and (4)PEG化衍生物是PEC-琥珀酰亞胺琥珀酸酯. Robert等[2)合PEG orthopynidyl disulidle中國煤化工這種雙酯可控制蛋白質的YHCN M H G種情況下,將羥基酸接到Vol. 23. 2003有機化學1344來的蛋白質.另-種可釋放的PECG街生物是由Benley等1.制備的,將mPEG茉基琥珀酰亞胺碳酸酯和mPFC苯甲酰胺PFG-0-C-0- -NPFG-O-C-0-N琥珀酰亞膠碳酸酯(團9)偶聯(lián)到溶菌酶的氨基上.偶聯(lián)物可在生理環(huán)境下使原來的蛋白質再生,且通過控制苯上取代基的位置來控制釋放的速率.1NII-CH:-CpH<7.0yR-NH.mPEG.)HmPEG、HHzC、PEG- -0-員y-CI2-CH水解mPEG ,0HR-NH2C=O團6 PEG苯并三疃或 PEC-琥珀酰亞胺琥珀酸酯偶聯(lián)到蛋白質圍8 PEG馬來酸酐與含有氨墓的蛋白質和肽類分子的耦合與的組氨酸殘基上釋放過程.Figure 6Corijueation o PECbenotriazode σ PEC sucinimidylFigure 8 Cojueption and rlese process of PCnectymaleiecarbonate to histidine on proteinsanbydride fom arnine containing proteins or ptidtes、,omPEG-O+CH)mCHC-OCI(CH)CH2C -0-mPEGox-50R-NI2mPEG- 0+H)mCHC-OCH(CH)CHC -NH-RYmPFG，mPFG-0-+C112)mCHCOI1HOCH(CH)CH2C -NH-Rk解+ R-NIl2團7 PEC 雙酯與蛋白質的偶聯(lián)和釋放過程示意(Y代表脂肪族和芳香族部分)圍9 PEC苯基琥珀酰亞胺碳酸酯與含有氨基的蛋白質和肽類Figure7 Corjupation and relee proces of PeC-double estes from分子的耦合與釋放過程pouteins (Y is an aliphatic or aromatic moie)Fgure9 Cijupaion end relee poces o PEC-hemg NHScarbonates from amine containing protein or pepidesPEG羧基酸(羧甲基.丙酸基或丁酸基)上形成存在一個酯鍵的PEC酸(圖7).再將末端的酸活化連接到蛋白質的ar或ε-Crenwald 等}321也合成了一種可釋放的PEG衍生物,它氨基上.PEG從蛋白質上釋放下來后,完全失活的蛋白質在通過1,6消除機理將原來的蛋白質釋放出來(圖10).而且蛋體內環(huán)境下可以有60%恢復活性. PBG雙酯的缺陷在于其白質的活性可以恢復到接近100%.所釋放出來的蛋白質含有一個易于引|起蛋白質免疫原性的最后的例子就是由Zalipkyp等1]設計的PEG衍生物,它末端.為了減少由于PEG化引起的活性損失,并避免從偶聯(lián)與蛋白質間形成苯甲基氨基甲酸酯的鄰位或間位二硫化物物上釋放出來的蛋白質可能引起的免疫原性,霜考慮選擇從連接鍵,在一個溫和的還原環(huán)境下通過非水解機理將可將原偶聯(lián)物上釋放出來的蛋白質不會引人新基團的PEG衍生物來 的氨基部分再生而把原來的蛋白質釋放出來(圖11).作為修飾劑.第一種符合上述想法的PEG街生物是Gaman2.2.中國煤化工，等測用來將PEC偶聯(lián)到組織血漿酶原激活劑和尿激酶的CNMH G人,合成異端雙功能基PEG馬來酐(圖8),兩種偶聯(lián)物均可在體內環(huán)境下驊放出原MHNo.12姜忠義等蛋白質和肽類分f的聚乙二醇化化學1345PEG衍生物的要求就提了出來,這類衍生物在PEG鏈的兩合成異端雙功能基的PEG衍生物的方法已得到較為迅端具有不同的兩個末端基團，其通式為X-PFG-Y,其中兩個速的發(fā)展，首選的端基有NHS酯、馬來酰亞胺、乙烯砜、吡啶獨立的功能基X和Y可分別與兩個具有不同特性的大分子基二硫化物、胺基和羧酸.在此舉幾例加以說明.相連接. PEG骨架提供了可溶性、生物降解性、柔順性和連接與PEG-SPA具有相近反應活性的fureseinePEG-NHS,單元X和Y的一定自由度.-端為黃光素部分 ,另一端為NHS活潑酯.與蛋白質和含氨基的分子偶聯(lián)后,可借助熒光分析方便地檢測偶聯(lián)物.mPEQ 8 HCQ、.0-PFGo COO-N0=H;CN0YR-NH2COOHmPEG吊 HzC:-NH-RFluorescein- PEG-NHSofOI1H,C'把異端雙功能基PEGs 一端的NH2用合適的保護基如OHH;C、CH3Fmoc或t-Boc保護起來,用另一端的活潑基團與目的化合物mPEQ進行反應.用無水三氟乙酸和強堿脫掉保護基后.游離出氨+ CO2+ R-NH2基,再與另一目的化合物偶聯(lián).OfNHS- Vinglsulfone (NHS-PEG- VS)和NHS-Maleimide (NHS-圖10PEG苯基琥珀酰亞胺碳酸酯與含有氨基的蛋白質和肽類PEG-MAL)為兩種異端雙功能基PEGs,乙烯砜和馬來酰亞胺基團在中性pH值附近即可與巰基反應,與氨基反應則需更分子的耦合與釋放過程高pH值.乙烯砜反應活性稍弱,但不易水解;馬來酰亞胺活FIgure 10Conjugation and release proces o[ PEG-phenyl NHS性稍強,但易水解.因此, NHS-PEG- vs和NHS-PEC-MAL.在修carbonates from amine containing proteins or peptides飾中可先將氨基與NHS活潑酯連接,再與筑基偶聯(lián).0Qo- .o-PEC-NmPEG.NHS-PEG-MAL| R-NH28(-0-PEG-5- -CH=CH2~NH-RmPECG、。 員NHS-PE0-VS| R-SHNHS-PEG生物素的一端為NHS活潑酯,用于和生物活CO2+ R-NH2性分子偶聯(lián);另一端為生物素,可與帶有親和素的配體連接，在靶向給藥研究中經常使用.Bentley 等[34]首先用苯醇引發(fā)PEG聚合生成苯基PEG圖11PEG苯基琥珀酰亞胺碳酸酯與含有氨基的蛋白質和肽類(Bz-PEG OH),其上的羥基可以轉化為第-個具有反應活性基團.苯乙基可以通過水解或氫解除去,而不會影響到第-Flgure 11 Corjugation and release process of PEG-phenyl NHS個活性基團的化學結構,這樣就又產生了一個可以加上第二carbonates from amine containing proteins or pepides個活性基團的新的末端羥基.制備異端雙功能基PEG一種這樣的異端雙功能基PEG衍生物可用作連接兩個分子最直接且較有前最的方法昆聚合法.用陰離子引發(fā)環(huán)氧乙烷用水終止聚合反應可以的親水、生物相容的間隔物.異端雙功能基PEG可以用于多中國煤化工化學方法活化rakogn種場合,如免疫分析，生物傳感.藥物靶向,液相多肽合成等.*YHCNMHG1346有機化學Vol. 23, 2003等([3)已用這種方法制備了一端帶羥基或甲氧基,而另一端結構在保護蛋白免于水解、阻止抗體接近、降低免疫原性等帶氨基的PEC衍生物.類似地, Nagasaki等l%)制備出了一端方面比同分子量的線性PEG有效得多Haris 等則)通過在一帶甲酸基另一端帶羥基的PFG衍生物.不過,該法也有局限個聚合物骨架的末端連接上一個具有三功能基的連接物如性,一是只有那些適合作為PEG末端基團且能引發(fā)聚合的絲氨酸或β-谷氨酸而合成出叉狀PEG.陰離子才可用,二是不能用于為了防止二醇形成而要求反應Amold等.1.合成了一種具有末端金屬螯合基團的PEG體系嚴格無水的場合.衍生物,這種分子含有兩個連接在中心氮原子上的游離羧基2.3PEG結構酸或氨基. PEG衍生物可將蛋白質從含有羧酸或氨基的水溶除了。上面線形PEG分子外,分支形PEG分子對與蛋白液中萃取或沉淀下來形成含有金屬離子的復雜化合物.質以及多肽的化學修飾也特別適合.第一種分 支形PEG街Matinez等[41合成了類似的化合物,他們將含有羥基的分子生物2,4二甲氧基聚乙烯6-s_=嗪(mPEG2氯=.嗪)是Inada偶聯(lián)上兩個末端羧基,從而產生了一種PEG化的前藥.等[37.以三嗪為核心合成的.此外,還研制了單臂雙功能基、雙臂雙功能基以及多臂Yamasaki等[3]第- -次以賴氨酸為核心合成了一種分支多功能基的衍生物,可將兩個或多個反應基團以--定距離隔形PEG結構. Veronese等[9)將兩個線形的PEG-BIC, PEC-SC .開,在模擬抗體活性區(qū)域及研究蛋白質作用時非常有用.鏈連到賴氨酸的a氨基和ε氨基上,合成了高純分支形PEG和PEG2(圖12).該偶聯(lián)方法可使用高分子量PEG,同時3結束語可合成出具有單活性末端基團的PEG衍生物.這些PEG衍生物可通過離子交換色譜純化，還可以進行進- - 步的衍生.近年來,隨著越來越多的PEG偶聯(lián)物應用于臨床試驗階段,人們逐漸意識到蛋白質和肽類的PEG化化學的重要性.正因如此,從第一-代PEG化化學到第二代PEC化化學之CH;O- +CH2CH2O)間的過渡非?？?可以預計,隨著大量新型PEG衍生物修飾CH-C-x1)劑的不斷出現(xiàn),蛋白質和肽類分子化學修飾的效率將不斷提SYN-CH2)4高148.4.CH2O- +CH2CH2O萬)(2)References1 Davis, F. F. Ad. Dnug Delinery Rev. 2002, 54, 457.CH:-(CH2CH2OmC82 Jiang, Z.-Y.; Gao, R.; Wang， Y.-Q. Aeta Phamn. Sin.CH;O- 4CH:CH2Otrg- N- +CH2)4'(3)2002. 37(5), 396 (in Chinese).(姜忠義，高蓉，王艷強，藥學學報, 2002, 37(5), 396.)3 Kozlowski, A.; Haris, J. M. J. Contoled Releae 2001, 72,圉12PFG的各種結構(1)分支形PEC(PEG2), (2)線形叉狀PrC, (3)分支形叉狀PEC4 Jiang, Z.Y.; Gao, R.; Xu, s.-W. Chin. Pharm. J. 2002, .Figure 12 Varous PEG configurations37(6), 409 (in Chinese).(1) Branched PEC (PEC2), (2) linear forked PEC aux! (3) brenched forked(姜忠義，高蓉，許松偉，中國藥學雜志，2002. 37(6),PEG409.)5 Hamis, J; Zalipky， s. Poly( ehylegrgeol) Chemistry and與線形PEG相比,分支形PEG具有-些獨特性質,例Biological Aplicaions, ACS Books, Washingou D. C.. 1997, p.如,相同分子量的分支形和線形PFG偶聯(lián)到蛋白質上,前者347的作用比后者要大得多分支形PEG另外的優(yōu)點是蛋白質6 Jiang, Z.-Y.; Xu, S.-W.; Gao, R. Palym. Bull. 2002, (1),的一個位點上可以同時接上兩個PEG鏈,這樣就很有效地34 (in Chinese).減少了蛋白質失活的幾率.另外分支形PEG還可有效地防(姜忠義，許松偉,高蓉，高分子通報, 2002, (1), 34.)止蛋白質水解,降低其抗原性以及免疫原性.7 Abuchowski, A.; vanEa, T.; Palcuk, N. C.; Davis, F. F.另一種PEG結構型式是叉狀PEC.叉狀PEG在一條J. Biol. Chem. 1977，252. 3578.PEG鏈或分支形分子的-端就有兩個活性基團,具有以下優(yōu)8 Inada, Y.; Funukawa, M. ; Ssaki, H. Trends Biotethnol. 1995,點:(1)產品純度好;(2)具有很大的空間位阻,只需單一位13(3), 86.點修飾,即可有效地在蛋白質或肽類分子表面形成聚合物的9 Gais, H. J.; Ruppert, s. Tetrahedron Llt. 1995, 36. 3837 .構象云;(3)對修飾位點有選擇性.反應基團處在兩條PEGFRudolph， s. Biocthnol.鏈的包圍之中,這樣高度的立體屏障使得mPEG-~NHS活潑中國煤化工的酯基只能靠近蛋白質表面最容易接近的位點;(4)其傘形TYHCN M H G Chen. 1993, 4, 568.No.12姜忠義等:蛋白質和肽類分子的聚乙二醇化化學134712 Veronese, F. M.; Lagjoli, R.; Boccu, E. ; Beassi,s C. A.;30 Garman, A. J.; Kalindjian, s. B. FEBS ltt.1987, 223, 361.Schiavon, 0. Appl. Biochem. Biotechnol. 1985. 11, 141.31 Zhao, X.; Benrdey, M. D. Ninth Intenational Symposiumn on13 Ahuchowski, A.; Kazo， G. M; Verhoest， C. R. CancerReent Aduances in Dnug Delinery System. Salt cily, Utah, 199,Biochem. Biophys. 1984, 7, 175.14 Harris, J. M.; Heraui, R. M. US 5252714，1993 [ Chern.2 lee, S; Crenwald, R. B.; McGuire, J; Yang, K.; Shi, C.Abstr. 1993, 120, 4058u].Bioconjiugate Chem. 2001, 12, 1635 Kinstler, 0. B.; Brems, D. N.; Iauren, s. L. Pharm. Res.33 Zalipeky, S.; Qazen, M; Walker. J. A.; Mullah, N.; Quin,1996, 13, 996.S. K.; Huang. s. K. Bicniugate (hemn. 1999 10, 703.16 Kinstler, 0. B.; Geg， C. V.; Freeman, A.; Boone, T. 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