2005年32(3)微生物學(xué)通報113燃料乙醇的代謝工程研究進(jìn)展尤蓉(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廣州510631)摘要:乙醇是來自可再生資源的最有發(fā)展前景的液態(tài)燃料,目前采用生物發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇仍然是最重要的途徑。利用代謝工程技術(shù)改造乙醇代謝網(wǎng)絡(luò)、提高乙醇產(chǎn)量是生物工程科學(xué)家的研究重點(diǎn)。從擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的代謝途徑等方面全面闡述了代謝工程技術(shù)在燃料乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞:乙醇,代謝工程,擴(kuò)展代謝途徑,構(gòu)建新的代謝途徑中圖分類號:Q93文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:0253-2645(2005)03-0113-04 Advances on Metabolic Engineering of Fuel Ethanol YOU Rong (College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631) Abstract: Ethanol is a renewable liquid fuel which has the most potential future. It is mostly produced by biofer- mentation. Many scientists pay attention to change ethanol metabolic network and increase ethanol productivity u- sing the technology of metabolic enginecring. This paper roundly illustrates that metabolic engineering is applied on fuel ethanol production from such as like extension of substrate use and design of new metabolic pathways. Key words: Ethanol, Metabolic engineering, Extension of substrate use, Design of new metabolic pathway酒精是一種應(yīng)用廣泛的有機(jī)化合物,在國防工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、食品衛(wèi)生、化學(xué)工業(yè)等行業(yè)都有廣泛的用途。所謂燃料酒精是指沒有添加變性劑的、可以作為燃料使用的無水乙醇,它具有和礦物質(zhì)相似的燃燒性能燃料酒精添加變性劑后,與無鉛汽油按一定的比例混配,可以形成一種新型綠色燃料:乙醇汽油。由于燃料乙醇的生產(chǎn)原料為玉米、薯干、糖蜜及植物秸稈等可再生的生物資源,所以使用乙醇或乙醇汽油作為汽油的替代品,不僅可以節(jié)省石油這種不可再生資源,還可降低污染排放百分之二十以上。因此,關(guān)于燃料乙醇的開發(fā)和研究在國內(nèi)外都受到了重視,各國政府都出臺相應(yīng)措施以實現(xiàn)能源的再生2。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的豐富和發(fā)展以及對代謝網(wǎng)絡(luò)的日益了解,代謝工程的內(nèi)容也更加豐富,代謝工程成為近年來發(fā)展很快的一個領(lǐng)域。不同學(xué)者對代謝工程的定義還不盡相同。 Bailey3曾把代謝工程解釋為:代謝工程是利用重組DNA技術(shù)通過操縱細(xì)胞的酶、轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控功能改善細(xì)胞的活動。而Serphanopoulous則認(rèn)為,代謝工程是利用重組DNA技術(shù)通過對胞內(nèi)特定生化反應(yīng)進(jìn)行修飾或?qū)胄碌纳磻?yīng)而對產(chǎn)品的生成或細(xì)胞的性質(zhì)進(jìn)行定向改變?？偟恼f來,代謝工程是對細(xì)胞內(nèi)代謝途徑網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行有目的地改變,以更好地利用細(xì)胞代謝進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化、能量轉(zhuǎn)導(dǎo)合通訊作者Tel:020-852113758317,e-mail: scnuyourong@126.com收稿日期:2004-07-30,修回日期:2004-09-24114微生物學(xué)通報2005年32(3)超分子組裝,它的研究對象是代謝網(wǎng)絡(luò)最終的目的是改變代謝流,提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率。傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)采用的菌種為釀酒酵母,由于乙醇對酵母細(xì)胞的毒性、酵母對底物利用的局限性以及大量副產(chǎn)物的生成等原因使得乙醇的產(chǎn)率不高,生產(chǎn)效率低下因此,為了提高乙醇的產(chǎn)率、改善細(xì)胞對乙醇的耐受性、拓寬底物利用范圍和最大程度降低副產(chǎn)物的生成,采用代謝工程技術(shù)對乙醇代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有目的的改造已成為世界范圍內(nèi)研究熱點(diǎn)。由于乙醇為酵母代謝的初級代謝產(chǎn)物,細(xì)胞對于這些初級代謝途徑具有極大的依賴性,如果采用改變原有的代謝流的代謝手段就會嚴(yán)重干擾細(xì)胞正常的生理生化過程,所以對于乙醇的生產(chǎn)主要采用的代謝工程手段有:代謝途徑的擴(kuò)展以及轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑,并獲得了重大進(jìn)展和突破,在本文中將綜合性地論述這些方面的進(jìn)展。1擴(kuò)展代謝途徑代謝工程中可以通過引入外源基因擴(kuò)展、延伸原來的代謝途徑,產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物,提高產(chǎn)率,或者利用新的底物作為生物合成的原料。在傳統(tǒng)的酵母發(fā)酵生成酒精的流程中,酵母因缺乏水解淀粉的酶類不能直接利用淀粉,淀粉需先經(jīng)過蒸煮、α-淀粉酶液化再經(jīng)過糖化酶糖化變成葡萄糖后才能利用,發(fā)酵工藝復(fù)雜,能源消耗較大,因此采用代謝工程技術(shù)擴(kuò)展代謝途徑直接構(gòu)建能利用淀粉的酵母工程菌可簡化工序和設(shè)備,減少能源消耗,降低成本,有良好的應(yīng)用前景。 Okumagai等從巴斯德畢赤氏酵母中分離了一個不受乙醇阻遏的醇氧化酶基因(AOX1)啟動子表達(dá)淀粉酶基因使α-淀粉酶分泌量大大提高,高達(dá)25mg/L,這個工程菌可以有效地由淀粉直接發(fā)酵乙醇,以3%淀粉至少產(chǎn)生2%乙醇;中山大學(xué)羅進(jìn)賢教授領(lǐng)導(dǎo)的科研小組克隆了黑曲霉糖化酶基因和細(xì)菌及帶麥α-淀粉酶并將這兩種基因共同和分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母獲得多株含雙基因和單基因的酵母工程菌。在不同的酵母啟動子、信號序列和終止位點(diǎn)的調(diào)控下,a淀粉酶和糖化酶基因在構(gòu)建的工程菌中高效表達(dá),表達(dá)的酶都分泌到胞外,在20%~25%淀粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,構(gòu)建的酵母工程菌可將其中的淀粉水解98%以上,產(chǎn)酒率在8%~10%。酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的途徑主要是通過丙酮酸來生成乙醇,其中丙酮酸脫羧酶(PDC)催化丙酮酸形成二氧化碳和乙醛,后者在乙醇脫氫酶(ADH)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖?由于丙酮酸在整個途徑中是個關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn),與諸多合成途徑均有密切聯(lián)系,因此通過強(qiáng)化表達(dá)細(xì)胞內(nèi)PDC和ADH的活性來擴(kuò)增目標(biāo)途徑,是構(gòu)建高產(chǎn)乙醇工程菌的主要戰(zhàn)略,而生長迅速、遺傳背景清楚、能利用廣范圍地碳源底物的大腸桿菌沒有這兩種酶,因此,為了提高乙醇的產(chǎn)量,Imgm將運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因構(gòu)成人工操縱子,插入到pUC載體上形成重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌中,該重組質(zhì)粒以葡萄糖為原料在氨芐青霉素的存在下發(fā)酵產(chǎn)生34gL乙醇;另外美國佛羅里達(dá)州立大學(xué)構(gòu)建了一株染色體上整合有移動發(fā)酵單胞菌的pdc和adhB基因的品質(zhì)優(yōu)良的大腸桿KO11,其在含有10%葡萄糖和8%木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基上可分別獲得54.4g/L和41.6g/L乙醇,這已經(jīng)接近0.5g乙醇g葡萄糖的理論產(chǎn)量,而且優(yōu)化大2005年32(3)微生物學(xué)通報115腸桿菌KO11工程菌株的各項研究仍在進(jìn)行,其中包括改善操縱子的遺傳穩(wěn)定性以及進(jìn)一步拓展工程菌發(fā)酵底物,使得KO11能夠利用戊糖、甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖等,大大降低了乙醇的生產(chǎn)成本12轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑①轉(zhuǎn)移代謝途徑:在酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的過程中最主要的副產(chǎn)物就是甘油,而且生成甘油的碳源在整個發(fā)酵過程占據(jù)了4%產(chǎn)生甘油的主要原因是在厭氧條件下,呼吸鏈不能起作用,這樣使NADH.還原成ND的唯一途徑就是通過甘油醇的形成,從而維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原電勢的平衡。甘油的生物合成途徑包括磷酸二羥丙酮在3-磷酸甘油脫氫酶(GPDH)的催化下還原為3-磷酸甘油,后者在3-磷酸甘油酯酶的作用下脫磷形成甘油,其中有GPD1和GPD2個基因編碼的3-磷酸甘油脫氫酶是限制性因素,但GPD2是最重要的部分。因此在篩選的 GPD2 cerevisiae突變株在厭氧條件下甘油的生成量減少了40%,乙醇的生成量提高了8%另外一種方法就是通過代謝工程的手段轉(zhuǎn)移代謝途徑來降低甘油形成,方法是通過在氨基酸合成過程中改變輔助因子需求,其基本原理如下:在野生型的菌株中存在由GDH編碼的 NADPH依賴型的谷氨酸脫氫酶催化完成的反應(yīng):α-酮戊二酸++APH→谷氨酸+nDP;而在酒酵母中存在另外兩種分別由GDH2和GD編碼的依賴NADH的谷氨酸脫氫酶催化完成的反應(yīng):α-酮戊二酸+NH+NADPH→谷氨酸+NAD,同時在釀酒酵母中存在另外一種合成谷氨酸的系統(tǒng):2a-酮戊二酸+谷氨酰胺+NADH→谷氨酸+NAD(由GLT1編碼的谷氨酸合酶催化),谷氨酸NHATP→谷氨酰胺+adp+pi(由ln編碼的谷氨酰氨合酶催化),因此構(gòu)建了一株敲除掉GDH1,但是過量表達(dá)GDH2或者是GLT1和GLN1的菌株TN19,結(jié)果乙醇的產(chǎn)率提高了10%,甘油的產(chǎn)率降低了38%。因此在整個過程中強(qiáng)化銨鹽的代謝流來達(dá)到提高乙醇產(chǎn)量的目的2②構(gòu)建新的代謝途徑:釀酒酵母(S. cerevisiae)具有高產(chǎn)酒精和耐高濃度酒精的優(yōu)點(diǎn),但是底物利用的范圍受到限制,而在木質(zhì)纖維素等多聚物的水解液中含有大量的戊糖和己糖如木糖、甘露糖和阿拉伯糖等都不能被S. cerevisiae利用或者是利用效率低下,但是 cerevisiae能利用木酮糖,如果培養(yǎng)基中存在細(xì)菌來源的木糖異構(gòu)酶(將木糖直接轉(zhuǎn)化為木酮糖),它們也能發(fā)酵木糖。酵母菌中的柄狀畢赤酵母依賴木糖還原酶(XR)將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇,木糖醇脫氫酶(XDH)將木糖醇轉(zhuǎn)化為木酮糖,木酮糖激酶(XK)將木酮糖轉(zhuǎn)化為5-磷酸木酮糖進(jìn)入磷酸戊糖途徑,但是這些酵母屬的乙醇生產(chǎn)能力很低,而且對乙醇的耐受性也不理想。因此,有人構(gòu)建了一組高拷貝的酵母菌-大腸桿菌穿梭重組質(zhì)粒,獲得的轉(zhuǎn)化子能同時有效的將木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇,而且這些克隆的木糖代謝基因的表達(dá)不再需要木糖誘導(dǎo),也不為葡萄糖所阻遏1313其他代謝工程手段另外,還可以通過構(gòu)建代謝旁路和改變能量代謝途徑等代謝工程手段提高乙醇產(chǎn)率,如Chen等成功地通過導(dǎo)入血紅蛋白基因,提高釀酒酵母的乙醇產(chǎn)量,血紅蛋白是通過影響電子傳遞鏈間接影響線粒體的乙醛歧化而起作用的,這條途徑產(chǎn)生的乙醇點(diǎn)116微生物學(xué)通報2005年32(3)總產(chǎn)量的三分之一(121;另外為了改良S. cerevisiae乙醇發(fā)酵過程特性還包括提高釀酒酵母對木質(zhì)纖維素水解物中酚抑制劑的抗性,將來自白色腐爛真菌地漆酶編碼基因置在PGK1啟動子地控制下,并轉(zhuǎn)化釀酒酵母,結(jié)果表明,漆酶地過量表達(dá)賦予了克隆菌對木質(zhì)纖維素水解物中酚抑制劑地高耐受性,從而改善了釀酒酵母由可再生原材料生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量總的說來,代謝工程技術(shù)是極具發(fā)展?jié)摿Φ纳锕こ碳夹g(shù),在研究中取得生產(chǎn)乙醇的高效菌種,如KO11、能夠直接利用淀粉的酵母等,但這些高效菌種也面臨一系列的問題:由于代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性導(dǎo)致優(yōu)良性能片斷丟失;由于環(huán)境等因素導(dǎo)致代謝流的改變而使得乙醇產(chǎn)量下降;底物利用的局限如自然界中大量的纖維二糖等依舊不能利用等等。雖然這些高效菌種還有待于更進(jìn)一步馴化成熟,有待于在工業(yè)化生產(chǎn)中接受更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn),但是代謝工程技術(shù)確實為燃料乙醇的生產(chǎn)提供了前所未有的發(fā)展機(jī)遇,將為人類實現(xiàn)清潔能源生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)等方面作出重大貢獻(xiàn)。參考文獻(xiàn) 1] Kheshgi H S, Prince R C, Marland. Annu Rev Energy Environ, 2000, 25: 199-244. [2] Roca C, Olsson Appl Microbiol Biotechnol 2003, 60: 560-563.3] Beiley JE. Seience,1997,2:1668~1675. [4] Stephanopoulos G, Aristidou A, Nielsen J. Metabolic engineering: Priciples and Methodologies. San Diego: Academic Press, 1998.5]張蓓編著.代謝工程天津:天津大學(xué)出版社,2003 [6] zaldivar J, Nielsen J, Olsson L. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 56: 17-34.7]吳淑魁,羅進(jìn)賢,陳海濱.釀酒科技,2004,122(2):61~64 [8] Ingram L O, Conway T, Clark D P, et al. Appl Environ Microbiol, 1987, 53: 2420-2425. [9] Ohta K, Beall D S, Mejia J P, et al. Appl Environ Microbiol, 1991, 57: 893-900 10] Dien B S, Hespell R B, Wyckoff H A, et al. Enzyme and Microb Technol, 1998, 23: 366-371. 11] Dien B, Iten L, Bothast R J. J Ind Microbiol Biotechnol, 1999, 22: 575-581. [12] Torben L N, Morten C K, Nielsen J, et al. Metabolic Enginecring, 2000, 2: 69-77. [13] Jeffries T W, Jin Y S. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 63: 495-509.[14]張惠展編著途徑工程,北京:中國輕工業(yè)出版社,2002《微生物學(xué)通報》第七屆編輯委員會主編:何忠效副主編:赫榮喬邱并生朱厚礎(chǔ)金城編委:(按姓氏筆劃排名)馬延和田波東秀珠劉雙江任改新莊玉輝遲乃玉蘇文金李俊吳清平陳曉英陳遠(yuǎn)童張博潤?quán)崙c斯鄭明索繼江陶文沂閻錫蘊(yùn)董金皋雷肇祖譚天偉