研究論文乙醇對(duì)角質(zhì)酶性質(zhì)的影響王莉,王淼k」,2(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫214122:2,食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無錫214122)摘要:研究了乙醇溶液對(duì)角質(zhì)酶性質(zhì)的影響,同時(shí)用圓二色光譜和熒光光譜法對(duì)經(jīng)過硫酸銨沉淀、鎳柱親和層析等方法獲得的電泳純角質(zhì)酶進(jìn)行了構(gòu)象研究。結(jié)果表明,在體積分?jǐn)?shù)40%30%和20%乙醇溶液中角質(zhì)酶催化反應(yīng)的最適溫度分別為50、55和65℃;在37℃下,酶在體積分?jǐn)?shù)20%~50%乙醇中具有較妤的穩(wěn)定性,體積分教30%和40%乙醇對(duì)角質(zhì)酶具有激活作用;角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)30%和50%乙醇中催化反應(yīng)的最適pH分別為9.5和9.0;在體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液中角質(zhì)酶的pH穩(wěn)定范圍為6.5~10.5。角質(zhì)酶在50℃的乙醇溶液中的失活動(dòng)力學(xué)研究表明,角質(zhì)酶的失活屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)(R2>0.98)。從角質(zhì)酶構(gòu)象的研究結(jié)果可以看出,在乙醇體系中角質(zhì)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)都發(fā)生了相應(yīng)的變化,關(guān)鍵詞:角質(zhì)酶;乙醇;酶學(xué)性質(zhì);構(gòu)象中圖分類號(hào):Q814.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1673-1689(2012)01-033-07Effect of Ethanol on the property of CutinaseWANG Li, WANG Miao“l(fā)2(1. The School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China: 2. State Key Laboratory of FoodScience and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122. China)Abstract: In this manuscript, effect of ethanol solutions on the biochemical property and conformation of cutinase were studied. The results showed that the optimum temperatures of cuti-nase were 65C, 55 C and 50 C respectively in 20%(V/V), 30% and 40% ethanol solutions.In 20% and 50% ethanol solutions cutinase was stable at 37C. In 30% and 50% ethanol solu-tions the optimum ph of cutinase were 9. 5 and 9. 0 respectively. In 30% ethanol solution theph stability range of cutinase was 6.. 5. In 30% and 40% ethanol solutions activity ofcutinase at 37 C was enhanced. The inactivation kinetic of cutinase was researched in ethanolsolutions at 50C. The results showed that the inactivation kinetic of cutinase in ethanol solu-tions followed the first order reaction(R2>0. 98). And the secondary and the tertiary structureconformations greatly changed in ethanol solutiods.Key words: cutinase, ethanol, enzymatic property, conformation生物酶作為高效的生物催化劑,傳統(tǒng)意義上是的催化反應(yīng)已經(jīng)倍受關(guān)注,酶學(xué)領(lǐng)域也有了一個(gè)全在水溶液中進(jìn)行的,但是,目前對(duì)其在有機(jī)溶液中新的分支一非水酶學(xué)(21。通常認(rèn)為在極性溶劑中中國(guó)煤化工收稿日期:2011-03-23基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20776063);國(guó)家計(jì)劃863項(xiàng)目(2011AA100905)CNMHG通倌作者:王森(1962-),女,江蘇無錫人,工學(xué)博士,教授博士研究生導(dǎo)師,主要從事食品生物化學(xué)方面的研究Email:mwang@jiangnan.edu.cn食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)2012年第32第1期WANG LI, et al, Effect of Ethanol on the Property of CutinaseResearch article酶的穩(wěn)定性較差,大部分非水相酶反應(yīng)均被限制于13試驗(yàn)方法相對(duì)非極性的溶劑中。一方面非極性溶劑利于提1.3.1pNPB水解酶活力的測(cè)定分光光度法。高酶的穩(wěn)定性,另一方面,在非極性溶劑中酶易于酶活在20℃下測(cè)定,反應(yīng)體積為1mL,其含20μL保持其活性構(gòu)象而表現(xiàn)出高的催化活力。極性有酶液、50mmol/L對(duì)硝基苯丁酸酯和50mmol/L硫機(jī)溶劑會(huì)爭(zhēng)奪酶分子表面的結(jié)構(gòu)水,使酶失活。因磺脫氧膽酸鈉pH為80的緩沖液980μL。在405此,對(duì)酶在有機(jī)溶劑中性質(zhì)及穩(wěn)定性的研究主要集mm記錄對(duì)硝基酚的生產(chǎn)速率。酶活定義:20℃下,中與非極性溶劑中3,4。每分鐘催化對(duì)硝基苯丁酸酯水解1μmol對(duì)硝基酚角質(zhì)酶是一種可以降解角質(zhì)并產(chǎn)生大量脂肪的酶量為一個(gè)酶活力單位口1。酸單體的水解酶,是a/B水解酶家族中相對(duì)分子質(zhì)1.3.2酶的分離與純化將發(fā)酵液于4℃量較小的成員,其活性中心含有典型的催化三元組10000r/min離心20min去除菌體,上清液經(jīng)質(zhì)量Ser1o、His1、Aspn5),具有酯酶和脂肪酶的功分?jǐn)?shù)50%的硫酸銨鹽析,4℃、1000r/min離心能。角質(zhì)酶可降解不溶性甘油三酯、可溶性酯和20min,得沉淀并透析,經(jīng)0.45m的濾紙微濾,然角質(zhì)等聚酯,也能破壞角質(zhì)多聚物分子的酯鍵使其后經(jīng)鎳柱進(jìn)行親和層析得純酶制品。水解為單體和小分子寡聚體6-。它作為一種多功1.3.3蛋白質(zhì)含量測(cè)定福林酚法。能水解酶,在食品、化工及紡織等諸多領(lǐng)域都具有L3.4 SDA-PAGE分析分離膠質(zhì)量濃度為12廣泛的應(yīng)用g/dL,濃編膠質(zhì)量濃度為2.5g/dL,電泳采用pH目前,國(guó)內(nèi)關(guān)于角質(zhì)酶的研究較少,國(guó)外對(duì)角8.3的 Tris-HO1緩沖體系,電泳后用考馬斯亮藍(lán)質(zhì)酶的研究大多集中于酶學(xué)性質(zhì)結(jié)構(gòu)以及生產(chǎn)菌G250染色株構(gòu)建、以及酶在反膠束體系中的性質(zhì)及應(yīng)1.3.5角質(zhì)酶性質(zhì)的研究角質(zhì)酶性質(zhì)研究采用用10-12,雖然有研究表明角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)75%硫酸銨分級(jí)沉淀、透析后的粗酶液。乙醇中20℃下放置18h活力基本不喪失1,但并1)角質(zhì)酶在乙醇溶液中的最適反應(yīng)溫度以未對(duì)酶在乙醇體系中的性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究。乙醇NPB為底物,用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液(20%、在工業(yè)中被廣泛應(yīng)用,是一種良好的有機(jī)溶劑許30%40%50%)配制pH8.0、20mmol/L的緩沖多食品原料中功能性成分的提取都是用乙醇作為液代替NPB水解酶活測(cè)定方法中的緩沖液,在不溶劑的,研究角質(zhì)酶在乙醇中的催化性質(zhì),將有助同溫度下(37~70℃)測(cè)定酶的剩余活力,以天然酶于擴(kuò)大角質(zhì)酶的應(yīng)用范圍。活力為100%確定該酶在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液中的最適反應(yīng)溫度。材料與方法如派潮2)角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)30%和50%乙醇溶液中1.1實(shí)驗(yàn)材料的最適反應(yīng)pH值分別用體積分?jǐn)?shù)30%和50%角質(zhì)酶發(fā)酵液:作者所在實(shí)驗(yàn)室提供;對(duì)硝基的乙醇溶液配制不同pH值(6.0~11.0)的緩沖液,苯丁酸酯(pNPB)、硫磺脫氧膽酸:購(gòu)自 Sigma公代替pNPB水解酶活測(cè)定方法中的緩沖液在其最司;其它試劑均為分析純?cè)噭＿m反應(yīng)溫度下測(cè)定酶的殘余活力,以天然酶活力為12實(shí)驗(yàn)儀器100%,研兗酶在體積分?jǐn)?shù)30%和50%乙醇溶液中ARB120電子天平:尤尼柯上海儀器有限公司最適作用pH。所用的緩沖液體系是用體積分?jǐn)?shù)產(chǎn)品;AB204N電子天平:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限30%和50%乙醇溶液配制,分別為:20mmol/L磷公司產(chǎn)品;EL20型pH計(jì):梅特勒托利多儀器有限酸緩沖體系(pH6.0~7.0);20mmo/ L Tris-HCl公司產(chǎn)品; Backman Coulter(USA)臺(tái)式冷凍離心緩沖液體系(pH7.5~9.0);20mmol/L磷酸氫二機(jī):上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;V-1800型可鈉-NaOH緩沖體系(pH9.5~11.0)。見分光光度計(jì):上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品;F3)角質(zhì)酶在Z醇溶溏中的熱穩(wěn)定性為了研7000熒光光譜儀:日本日立公司產(chǎn)品;MOS450兗該酶的中國(guó)煤化工夜(20%、30%,AFCD圓二色光譜儀:法國(guó) Bio-logic公司產(chǎn)品。40%、50%CNMHG一定比例分別與不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液配制的pH8.020mmol/G Journal of Food Seence and Bloteehnolot Vol32 No. 1 2012研究論文」王莉,等:乙醇對(duì)角質(zhì)酶性質(zhì)的影響L. Tris-HCI緩沖液混合在37、45、50和55℃保溫,9.75%,以上各步的純化結(jié)果如表1所示。每隔一定時(shí)間取出部分酶液,立即在冰浴中冷卻,按pNPB水解酶活力測(cè)定方法測(cè)定殘余酶活4)角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)30%和50%乙醇溶液中的pH穩(wěn)定性將酶在37℃、不同pH值(pH6.0~11.0)的緩沖液中放置12h,每隔一段時(shí)間取出部分酶液,按pNPB水解酶活力測(cè)定方法測(cè)定殘留酶活。緩沖液體系同1.3.7。5)酶在乙醇溶液中的失活動(dòng)力學(xué)將酶液按定比例分別與體積分?jǐn)?shù)20%、30%、40%、50%乙醇溶液配制的pH8.0、20mmol/ L Tris-HCI緩沖液混合,在50℃下放置一定時(shí)間,每隔一定時(shí)間取Lane 1: Purified cutinase; Lane 2: Molecular weight marker(A出部分酶液,按pNPB水解酶活力測(cè)定方法測(cè)定殘97400;B.66200C,43000D,3100余酶活。圖1pNPB水解酶的 SDS-PAGE凝膠電泳根據(jù) Arrhenius方程lnA=-kt和lnk=lnknFig. I SDS-PAGE of cutinase(E/RT)計(jì)算失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)。其中A是酶活,U/ml;T是絕對(duì)溫度,K;E是活化能;t12是半衰表1角質(zhì)酶純化過程參數(shù)期,min;t是保溫時(shí)間,min;R是氣體常數(shù),8.314Tab. I The parameters of cutinase purification510J/(K·mol);k是速率常數(shù),1/min純化總酶活/U收總蛋自質(zhì)/比酶活/純化過程1.3.6角質(zhì)酶在醇溶液中的構(gòu)象圓二色光譜檢U/mg)倍數(shù):將純化后的樣品溶解于pH8.0、20mmol/Ll的粗酶液37384.40100.001965.9519.021.00Tris-HCl緩沖液中室溫放置30min,立即冰浴;樣鹽析37111.9599.27975.4538.052.00品溶解于體積分?jǐn)?shù)30%、50%乙醇溶液配制的pH透析36858.6498.59896.06·41.132.168.0、20mmol/L.Tris-HCl緩沖液中,各自分別在鎳柱層析3646.689.7531.36116.286.1237℃、50℃下放置30min,立即冰浴。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.1mg/ml。測(cè)定遠(yuǎn)紫外區(qū)(190~250nm22角質(zhì)酶在乙醇溶液中的性質(zhì)CD譜,掃描速度1nm/s,重復(fù)5次。圓二色譜用平2.2.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)角質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度的影均橢圓度[0]表示,單位為度·厘米2分摩爾(deg響溫度是影響酶催化作用的主要因素之一,一方dmol面隨著溫度的升高,化學(xué)反應(yīng)速度加快,另一方面cm熒光光譜檢測(cè):樣品處理方式同圓二色光譜檢高溫會(huì)使酶變性失活,有機(jī)溶劑的加入也會(huì)影響酶測(cè)。熒光掃描采用F7000FL型分光光度計(jì),激發(fā)反應(yīng)的最適溫度。因此,需要通過實(shí)驗(yàn)確定酶在有波長(zhǎng)為280mm,發(fā)射波長(zhǎng)為290~450nm15-20。機(jī)介質(zhì)中酶催化的最適溫度,以提高酶催化反應(yīng)速率2結(jié)果與分析在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液中,角質(zhì)酶的最適反2.1角質(zhì)酶的分離純化應(yīng)溫度也不同,且不同于酶在正常情況下的最適作用溫度60℃。由圖2可知,體積分?jǐn)?shù)20%、30%將含有角質(zhì)酶的發(fā)酵液通過硫酸銨分級(jí)鹽析、和40%乙醇溶液中,酶的最適反應(yīng)溫度分別為透析、鎳柱親和層析進(jìn)行分離純化,純化表見表1,得到的樣品通過 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)只顯現(xiàn)65℃、55℃和50℃,且當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于40%時(shí),出一條譜帶,說明純化的角質(zhì)酶已達(dá)到電泳純(圖角質(zhì)酶的催化中國(guó)煤化工度中,該體系1)。純化后pNPB水解酶比活力從19.02U/mg提對(duì)角質(zhì)酶具有G%乙醇溶液NMHG高到1128U/mg,純化倍數(shù)為6.12,回收率為中的酶活力最高可再版下時(shí)2倍,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí),酶活力顯著降低。有研究表明食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)2012年第32卷第1期⑤WANG Li, et al: Effect of Ethanol on the Property of CutinaseResearch article上述現(xiàn)象可能是由于適當(dāng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇改變了酶50℃55℃的構(gòu)象,從而使酶分子更有利于與底物接觸進(jìn)行催化反應(yīng),當(dāng)乙醇濃度過高時(shí),它對(duì)酶構(gòu)象的改變超出了酶的承受能力使酶變性,酶活力下降甚至失活2。20%一-30%一40%—50%→套6080100時(shí)間min(b)-37℃45℃12050℃3540455055606570圖2不同體積分?jǐn)?shù)乙率角質(zhì)藺的最佳反應(yīng)溫度Fig 2 Optimal temperature of cutinase in ethanol solutions2.2.2角質(zhì)酶在乙醇溶液中的熱穩(wěn)定性研究角質(zhì)酶在乙醇溶液中熱穩(wěn)定性研究表明(見圖3)。在體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液中,45℃以下酶活基本保持時(shí)間/min不變,酶相對(duì)穩(wěn)定。溫度高于45℃時(shí),隨著溫度的升高,酶的穩(wěn)定性顯著降低(圖3(a));在體積分?jǐn)?shù)-37℃12030%乙醇溶液中,37℃時(shí)酶穩(wěn)定性較好,在此條件下保溫100min后,殘余酶活仍比在緩沖液中的原始酶活高。但在45℃下酶的穩(wěn)定性有所下降,且隨著溫度升高酶穩(wěn)定性快速下降(圖3(b));當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%~50%時(shí),酶只在37℃具有較好的20熱穩(wěn)定性(圖3(c)、(d)。這說明酶在高體積分?jǐn)?shù)時(shí)間的乙醇溶液中,只有在低溫下具有較好的穩(wěn)定性角質(zhì)酶在水溶液中40℃下保溫70h,殘留酶活仍圖3角質(zhì)確在乙醇溶液中的熱穩(wěn)定性abcd分別為角在80%以上;在60℃時(shí)半衰期為42h。,與此相質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)20%、30%40%和50%乙醇中的熱比在乙醇溶液中熱穩(wěn)定性有所下降。乙醇是與水穩(wěn)定性)互溶的極性溶劑,會(huì)與酶爭(zhēng)奪水分子,甚至剝除蛋Fig.3 Thermostability of cutinase in ethanol solutions a白質(zhì)分子的“必需水”層,擾亂酶分子天然構(gòu)象的形(20%),b(30%),c(40%)andd(50%)成,在乙醇存在的條件下,高溫更易使酶變性,從2.2.3角質(zhì)酶在乙醇溶液中的最適pH值由上而使酶在醇中的穩(wěn)定性降低。述研究結(jié)果可知角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液中的催化活性最高,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于30%時(shí),37℃-45℃12050℃55℃角質(zhì)酶的催化活性下降,達(dá)到體積分?jǐn)?shù)50%時(shí)只在10037℃下有一定的穩(wěn)定,選擇研究體積分?jǐn)?shù)30%和8050%乙醇中角質(zhì)酶的最適反應(yīng)pH值具有代表性。60前人研究表明,角質(zhì)酶在水溶液中的最適pH8.01,乙施晶活nH值的影響如圖4所20示,角質(zhì)酶中國(guó)煤化工H值發(fā)生了20406080100時(shí)間/m改變,在體NMHG液中的最適反應(yīng)pH值分別為9.5和9.0,在體積分?jǐn)?shù)30%乙醇30 Journal of Food Science and Biotechnology Vol 32 No. 1 2012研究論文王莉,等:乙醇對(duì)角質(zhì)酶性質(zhì)的影響溶液中pH8.0~10.0范圍內(nèi)酶活變化不大,但均pH6.0H95pH11.0H80—0pH10.5比在水溶液中有大幅提高,當(dāng)pH為9.5時(shí),最大活150pH6.5H7.0力是水中的2.45倍。很多研究表明酶在有機(jī)介質(zhì)中催化反應(yīng)的最適pH值通常與酶在水溶液中反應(yīng)的最適pH值接近或相同,這主要是針對(duì)非極性有機(jī)溶劑而言,乙醇是與水互溶的極性溶劑,它對(duì)角質(zhì)酶的激活效應(yīng)有待進(jìn)一步探討體積分?jǐn)?shù)30%乙醇體積分?jǐn)?shù)50%乙醇時(shí)間h(b)圖5角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)50%(a)、30%(b)乙醇中的pH穩(wěn)定性Fig 5 pH stability of cutinase in ethanol solutions (a)(50%)and(b)(30%)2.2.5角質(zhì)酶在乙醇溶液中的失活動(dòng)力學(xué)為了進(jìn)一步探索分析不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)角質(zhì)酶活力的影響,作者對(duì)50℃下角質(zhì)酶的失活動(dòng)力學(xué)進(jìn)行圖4角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)30%、50%乙醇中的最適反應(yīng)pH值研究,不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下角質(zhì)酶的失活動(dòng)力學(xué)曲Fig.4 Optimal pl of cutinase in ethanol solutions線見圖6所示2.2,↓角質(zhì)酶在乙醇溶液中的pH穩(wěn)定性由角體積分?jǐn)?shù)20%乙醇質(zhì)酶在乙醇溶液中最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性可體積分?jǐn)?shù)40%乙醇知,37℃時(shí)角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)50%以下的乙醇溶一體積分?jǐn)?shù)30%乙醇一體積分?jǐn)?shù)50%乙醇液中都具有一定的穩(wěn)定性,且角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液中活性最高;從角質(zhì)酶在乙醇溶液中最適反應(yīng)pH的研究結(jié)果可知,角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液具有一定的酶活,且乙醇作為一種食55品級(jí)的有機(jī)溶劑,高體積分?jǐn)?shù)的乙醇在工業(yè)中被廣泛應(yīng)用,因此研究角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)50%乙醇中的H穩(wěn)定性是有必要的。角質(zhì)酶在乙醇中的pH穩(wěn)定性如圖5所示,在體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液中,角質(zhì)酶的pH穩(wěn)定性較差,短時(shí)間內(nèi),在pH6~7的范圍內(nèi)時(shí)間/min有一定穩(wěn)定性,當(dāng)pH到9.0時(shí),酶的穩(wěn)定性迅速下圖6角質(zhì)酶在醇溶液中的失活動(dòng)力學(xué)曲線降(圖5(a)),而在30%乙醇溶液中,角質(zhì)酶較穩(wěn)定,rg.6 Inactivation curves of cutinase in ethanol solutionspH穩(wěn)定范圍為pH6.5~10.5(見圖5(b)。從圖6可以看出,角質(zhì)酶的失活反應(yīng)基本符合150pH6.0一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的規(guī)律,利用 Arrhenius方程可以pH 6.5計(jì)算出各種失活動(dòng)力學(xué)參數(shù),結(jié)果如表2所示。120pH8.0從表2可以看出,隨著醇體積分?jǐn)?shù)的增大,酶-pH9.0的失活速率常數(shù)增加,失活的活化能下降。角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液中半衰期為71.63min,而在體積分?jǐn)?shù)溶中其半期迅速下降到5.23min中國(guó)煤化工會(huì)很快失活681012CNMHG時(shí)間h酶失活的活性有關(guān),E。越大角質(zhì)酶越穩(wěn)定,由此也可以看出隨著醇體積分?jǐn)?shù)食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)2012年第32卷第1期6WANG Li,et al: Effect of Ethanol on the Property of CutinaseResearch Article的增大,角質(zhì)酶的穩(wěn)定性在下降。條件下角質(zhì)酶的熒光強(qiáng)度。蛋白質(zhì)在340nm左右表2角質(zhì)酶在醇溶液中的失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)的熒光強(qiáng)度主要與蛋白質(zhì)分子中Trp和Tyr殘基Tab.2 The inactivation kinetic parameters of cutinase in eth-的暴露和解離的程度有關(guān)221.熒光發(fā)射光譜的anol solutions變化與生色基團(tuán)的微環(huán)境等多方面因素相關(guān)。由失活速率活化能半衰期此推測(cè),角質(zhì)酶在37℃下30%乙醇中三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)體積分?jǐn)?shù)/%常數(shù)kE()生了有利于催化活性的變化0.009617636.07表3角質(zhì)酶分子構(gòu)象中各結(jié)構(gòu)單元含量0.053112997.2213.89Tab 3 Secondary structural compositions of cutinase0.105611106.916.86處理方式螺旋/%折疊/B轉(zhuǎn)角卷曲0.118610712.082.2.6角質(zhì)酶在醇溶液中的構(gòu)象上述研究表明30%乙醇、37℃9.2445.8810.8433.94角質(zhì)酶在37℃體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液中具有較30%乙醇、50℃55.663.4019.4220.52高活性,且有較好的穩(wěn)定性,為此,作者對(duì)角質(zhì)酶的構(gòu)象進(jìn)行了研究。圖7是角質(zhì)酶在不同溫度下、不50%乙醇、37℃9.1145.9510.9133同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中放置30min后測(cè)得的圓50%乙醇、50℃9.3245.7910.7234.17色圖譜。-30%37℃緩沖液50%37℃37℃30%緩沖液37℃50%50%50℃30%50℃50℃30%210N50℃50%2300320350380410440波長(zhǎng)/nm波長(zhǎng)/圖7不同方式處理后角質(zhì)酶的圓二色光譜圖8不同方式處理后角質(zhì)酶的熒光發(fā)射光譜圖Fig. 7 Circular dichroism spectrums of cutinase incubatedig. 8 Fluorescence intensity of cutinase incubated 30min in30min in different waysdifferent ways從圖了可以看出:在不同體積分?jǐn)?shù)的乙液【結(jié)語件分析,得出角質(zhì)酶在不同體系中α螺旋、β折疊、B1)角質(zhì)酶在低體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中的催化轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲的比例(見表3)。從表3的數(shù)據(jù)性質(zhì)發(fā)生了變化。20%、30%、40%乙醇溶液中的可以看出,酶的相對(duì)活力與其二級(jí)結(jié)構(gòu)之間沒有明最適溫度分別為65、55、50℃。熱穩(wěn)定性研究表顯的相關(guān)性。因此作者采用熒光光譜法對(duì)酶蛋白明,在37℃下,酶在體積分?jǐn)?shù)20%~50%乙醇中都的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。圖8是不同體系具有較好的穩(wěn)定性。中角質(zhì)酶的熒光發(fā)射光譜,角質(zhì)酶在336~342nm2)角質(zhì)酶在體積分?jǐn)?shù)30%和50%乙醇中催化處有一特征熒光發(fā)射峰,但在50℃下、體積分?jǐn)?shù)反應(yīng)的最適pH分別為9.5和9.0。在30%乙醇溶50%乙醇中角質(zhì)酶的熒光發(fā)射峰位紅移至342m,液中角質(zhì)酶的pH穩(wěn)定范圍為65~10.5;在50%其他條件下角質(zhì)酶的熒光發(fā)射峰未發(fā)生位移,只是乙醇溶液中中國(guó)煤化工熒光強(qiáng)度不同,對(duì)于活力較高的37℃下30%乙醇3)角質(zhì)CNMHG的失活動(dòng)力學(xué)中的角質(zhì)酶,在336m的熒光強(qiáng)度明顯低于其他研究表明,角質(zhì)酶的失活屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)(R6> Journal of Food Science and Blot echnology Vol32 No. 1 2012研究論文王莉,等:乙醇對(duì)角質(zhì)酶性質(zhì)的影響>0.98)。活性沒有明顯相關(guān)性,但與三級(jí)結(jié)構(gòu)有很大的相關(guān)4)用CD光譜法和熒光光譜法對(duì)電泳純的角質(zhì)性,且角質(zhì)酶在37℃下30%乙醇中三級(jí)結(jié)構(gòu)可能酶進(jìn)行構(gòu)象研究表明,角質(zhì)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)與其催化發(fā)生了有利于催化活性的變化參考文獻(xiàn)( References)1]陳晟,陳堅(jiān),吳敬.一種嗜熱細(xì)菌來源角質(zhì)酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[冂].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2009,15(6):846-850CHEN Sheng, CHEN Jian, WU Jing. 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