植物生理學通訊第39卷 第5期，2003年10月547乙烯信號的接受與轉導楊迎伍1.2李正國1.2.”張利陳國平2(西南農業(yè)大學 食品科學學院.重慶400716;6 3重慶大學基因工程研究中心，重慶400030)Reception and Transduction of Ethylene SignalYANG Ying Wult, LI Zheng Guol.2.* , ZHANG Li' , CHEN Guo Ping2 (' College of Food Science, Southwest Agricultur-al University, Chongqing 400716; "Gene Engineering Research Center, Chongqing University, Chongqing 400030)提要對乙烯信號轉導途徑的相關組分.乙烯信號的轉導途徑以及乙烯信號感知和轉導的可能機制研究的最新進展進行了簡要介紹,并對今后這一領域的研究方向和在農業(yè)上的應用前景進行了探討。關鍵詞乙烯; 受體;信號轉導乙烯是五大類植物激素之一,作為-種內源性相關的突變體。而且在擬南芥(Arabidopsis thali-調節(jié)因子在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用1。ana)中,由于“三重反應”法具有很好的重現性、易乙烯對植物的生長和發(fā)育過程的影響包括:種子萌于篩選大量的個體(> 10*),以及在生長的早期階發(fā)、對莖和根伸長的抑制、開花、花和葉的衰老和脫段(3 d)就可進行篩選等優(yōu)點,所以，“三重反應”法落、性別分化、果實成熟等1.2]。此外,乙烯還參與為乙烯反應突變株的分離提供了一種簡單易行的植物脅迫反應,影響植物偏上性生長等。由于乙烯篩選方法。采用“三重反應”法已篩選出許多乙烯對植物生長發(fā)育的重要影響,因而成為植物生理的反應突變體。根據已分離的突變體可分為兩類[問:重要研究內容。一類是乙烯不敏感突變體(ethylene insensitive以前,對乙烯的研究主要集中在乙烯的生理效.mutants)，即對外源乙烯不顯示出“三重反應”,如應、生物合成途徑及其調控上。植物中乙烯可受多乙烯不敏感突變體(ethyleneinsensitive,ein)、抗種刺激而誘導合成,如傷害、病蟲侵害、各種脅迫因乙烯突變體(ethylene- resistant, etr). 集約ACC突素、機械傷害、植物激素(如生長素、細胞分裂素.乙變體(ACC-intensive, ain);第二類是組成型乙烯烯)、果實成熟、衰老等1.3]。乙烯的生物合成途徑，反應突變體( constitutive ethylene response mu-從Met-→SAM-→+ACC-→C2 H,已經清楚[]。在多種tant, ctr), 即在無外源乙烯存在下能組成型地顯植物中,編碼1- 氨基環(huán)丙烷1羧酸(1-aminocyclo-現“三重反應”，如乙烯過量表達突變體( ethylene-propane-1-carboxylic acid, ACC)合成酶和ACCoverproducer, eto)等。氧化酶的基因已經克隆和鑒定,并通過反義RNA1乙烯信號轉導的相關組分技術對兩種酶的基因進行了遺傳學操作從而為控1.1乙烯受體多年來, 研究者們推測乙烯需與制果實成熟和衰老提供了一種有效的方法。近年受體結合后才能對植物產生生理作用。近年來,通來,分子生物學和分子遺傳學的長足發(fā)展,加速了過對乙烯受體蛋白的研究,為這-推測提供了許多有力的實驗證據。植物乙烯信號轉導的研究。在研究乙烯信號轉導過程中,廣泛應用了“三1.1.1 ETR1基因及其編碼的蛋白 在擬南芥中重反應”法和分子克隆技術。“三重反應”是指當黑利用“二重后應”表現刑監(jiān)定了第一個乙烯不敏感中國煤化工酒暗條件下生長的黃化幼苗暴露于乙烯后,其下胚軸突TYHCNMHG通過定位克隆被分膨脹變短、莖桿偏向水平生長、頂端鉤狀彎曲加收稿2002-09-04修定2003-01-27劇5。由于乙烯感受抑制劑、乙烯生物合成抑制劑資助重慶市應用基礎項目 (合同號:6477)和生物力學與組織工和植物喪失乙烯反應的突變體都能阻礙三重反應程教育部重點實驗室訪問學者基金項目。的發(fā)生,質帝敬堡定、分離出乙烯合成及信號轉導通訊作者( E mail: zhengguoli@ yahoo. com, Td :023 65 120483)。548植物生理學通訊第39卷 第5期，2003年10月離[6。表達ETR1蛋白的轉基因酵母可與乙烯結與ETR1一樣都是乙烯受體。合,表明ETR1是乙烯受體,在乙烯信號轉導途徑.Sakai等[103鑒定出ETR2基因,并發(fā)現etr2突的初期起作用”。變體與etr1和ers突變體相似,表現出顯性的乙烯ETR1編碼的蛋白為一跨膜蛋白，N-端位于不敏感表型。經雙重突變型的上位性分析證明，細胞質膜的外側,C端結構域定位在膜的細胞質一ETR2在乙烯信號轉導途徑中作用于CTR1的上側C0]。其中,N-端含有一個包含3個跨膜節(jié)段的疏游,ETR2基因位于第3條染色體上。無論在序列水結構,是結合乙烯的活性區(qū)域;C端含有組氨酸上,還是在突變體表型上ETR2和ERS都很相似，激酶區(qū)域和接收區(qū)域。與細菌的雙組分調節(jié)器因而推測ETR2與ETR1和ERS具有類似的功(two-component regulators)有高 度同源性問]。細能。因此，在擬南芥中,ETR2可能編碼第3個乙菌的雙組分調節(jié)器包括傳感蛋白和反應調節(jié)器。烯受體。然而,迄今僅獲得了一個ETR2的顯性等傳感蛋白定位在細胞膜上,由一個輸入端和一個組位基因,ETR2結合乙烯的能力尚未被確定。因氨酸蛋白激酶結構域構成;反應調節(jié)器由一個接收此,還不能確認ETR2 -定編碼一種乙烯受體蛋結構域和一個輸出結構域構成。在傳感蛋白上,通.白。過輸入結構域感受信號,激活或抑制組氨酸激酶活根據結構的相似性,乙烯受體基因家族可分為性。激活的組氨酸激酶上的一個組氨酸殘基會發(fā)兩個亞家族(subfamily),即ETR1亞家族和ETR2生自動磷酸化作用,然后磷?；鶊F轉移到反應調節(jié)亞家族11。ETR1亞家族包括ETR1和ERS1,編器中接收結構域的一- 個天冬氨酸殘基上,從而調節(jié)碼的蛋白含-個保守的組氨酸激酶結構域和在N-反應調節(jié)器中的輸出結構域的活性。在細菌中,輸端有3個疏水亞結構域。ETR2 亞家族包括入結構域通常有一個DNA結合基元,并直接調控ETR2、EIN4和ERS2,編碼的蛋白N-端含有一個轉錄過程。通過模擬細菌雙組分調節(jié)器的研究表附加的疏水突出端,且組氨酸激酶結構域缺乏一個明,ETR1通過N端感受乙烯,并把結合信號傳遞或幾個催化活性所必需的元件。到組氨酸蛋白激酶區(qū)域和接受器區(qū)域。另外,在番茄中也分離得到6個ETR1的同源現在已知擬南芥ETR1蛋白有738個氨基酸基因[12]。Wilkinson 等[13] 發(fā)現番茄Nr ( Never-殘基,相對分子量為82.5 kD8]。另外,ETR1 蛋白ripe )突變體基因編碼一個與ETR1高度相似的蛋在酵母中的表達研究發(fā)現,ETR1蛋白是與膜結合白,并從中克隆出Nr基因。Nr蛋白與ERS相似，的(這與推斷結果一致)、通過二硫鍵連接的二聚也缺乏一個接受器結構域。Tieman 和Kleel4]在體。而二硫鍵是通過ETR1蛋白中位于細胞外區(qū).番茄中還分離鑒定到ETR1同源基因LeETR1、域的前4個氨基酸殘基中的半胱氨酸相連接的叮。LeETR2、LeETR4、LeETR5。LeETR1、 LeETR21.1.2 ETR1基因的同源物 在擬南芥中, ETR1和Nr相當于擬南芥的ETR1亞家族，而代表一個小的基因家族。目前已發(fā)現與ETR1同LeETR4、LeETR5則相當于擬南芥的ETR2亞家源的基因有: ERS1. ERS2、ETR2和EIN4[8~10]。族。將擬南芥ETR1基因轉入番茄中進行異源表目前認為EIN4和ETR1在乙烯信號轉導途徑中達,發(fā)現果實成熟和花的衰老都顯著延遲,這表明是最早起作用的。植物對乙烯識別和反應路徑有高度的保守性[15]。ERS(ethylene response sensor) 基因是在擬南1.2 其它組分 除了編碼乙烯受體的幾個基因芥與etr1的交叉雜交中發(fā)現的。ERS 基因已經克外,還發(fā)現乙烯信號轉導途徑中的其它幾個組分，隆,它位于第2條染色體上,與λAT429標記相如(中國煤化工、ERF和ERN1等。鄰[8]。據推測,ERS編碼第2個乙烯受體蛋白,但1.2YHCNMHG,Kieber等16通過插此受體缺乏反應調節(jié)器結構域(此結構存在于入突變在擬南芥中克隆了CTR1基因,并對其結構ETR1蛋白中)。上位性分析表明,ERS1作用于進行了研究。該基因編碼的蛋白由821個氨基酸CTR1(信號轉導途徑中的另一組分)的上游,這與殘基組成,相對分子量為90 kD。推斷的氨基酸序在etr1突變體本現察到的結果一致。因此ERS1 .列顯示,C-端具明顯的類似于哺乳動物和果蠅中.植物生理學通訊第39卷 第5期，2003年10月549Raf蛋白激酶家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(ser-于N-端),且N-端和C-端都位于膜的同側。可見，ine/ threonine protein kinase)的特征,含有所有已EIN2蛋白是一種膜內在蛋白。對EIN2蛋白的序知的蛋白激酶所共有的11個亞域,兩者的氨基酸列分析還發(fā)現,EIN2蛋白與Nramp蛋白家族在序序列同源性達41%。通過桿狀病毒載體把CTR1列上有相似性,但這種相似性僅局限在N-端，C-端.基因導入昆蟲細胞中表達的實驗表明,CTR1蛋白則無同源性。Nramp蛋白是存在于真核細胞中的具備絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性。在動物體中，-種蛋白,它是 作為二價陽離子的轉運蛋白。與Raf蛋白是分裂原激活的蛋白激酶激酶激酶Nramp的相似性暗示著EIN2可能作為一種金屬(MAPKKK)。不同的Raf蛋白均含有3個高度保轉運蛋白在乙烯信號反應中起作用。但異源轉化守的區(qū)域(CR1~3)。CR1由Raf 蛋白結合位點和實驗中，并沒有發(fā)現EIN2具有轉運金屬的能富含Cys的鋅指(zincfinger)結構組成;CR2的氨力[18。現已證實,在乙烯信號轉導途徑中, EIN2基酸殘基中，絲氨酸和蘇氨酸占了極大比例;CR3作用于CTR1的下游,EIN3的上游。位于Raf蛋白的C端,是激酶的催化區(qū)域。CTR1EIN3突變雖然會使植株對乙烯的敏感性減的C-端與CR3區(qū)域高度同源,但CTR1缺乏CR2弱,但并不完全失去對乙烯的敏感性,這可能是由區(qū)域中的鋅指結構和結合位點[16]。于EIN3代表一個具有豐余功能的小基因家族。對所有的ctrl突變體(包括激酶中最保守的殘Chao等[19]研究表明,EIN3編碼一種核蛋白,在乙基上單個氨基酸的突變)分析表明,CTR1的激酶烯信號轉導中作為核調節(jié)因子起作用。EIN6 和活性在乙烯反應途徑中是必需的,充當負調節(jié)物的EIN7在乙烯信號轉導途徑中起作用的確切部位還作用[16]。不清楚。CTR1的N-端具體功能還不清楚1。在N-Tieman等[30]在番茄中分離了EIN3的同源端結構上,CTR1與Raf僅有非常有限的同源性，基因LeEIL(LeEIL1、LeEIL2、LeEIL3)。降低單CTR1的N-端不含有哺乳動物細胞中Raf蛋白上- 的LeEIL基因表達的轉基因番茄在乙烯反應上的保守鋅指。CTR1的N-端含有一個共有的P-沒有大的變化,但抑制多個LeEIL基因的表達則loop序列,此P-loop序列是一個核苷酸結合折疊對乙烯的敏感性會大大降低。降低LeEIL的表達結構。但P-loop序列是否就代表CTR1的功能結會誘導枝葉偏上性、花脫落、花衰老以及果實早熟構域,還有待進-步研究1。等。說明LeEIL基因為功能豐余基因，在多重乙CTR1蛋白是乙烯信號轉導的中心組分,它作烯反應中作為正調節(jié)因子調節(jié)植物生長發(fā)育。我用于乙烯受體蛋白的下游，是EIN2、EIN3、EIN5們在番茄中通過EIN3 -GFP ( green fluorescent的負調節(jié)因子[16]。protein)標記發(fā)現它定位于細胞核中。超表達1.2.2EIN組分ein突變體是對乙烯不敏感的EIN3可以使Nr突變體具有正常的乙烯反應,果突變,在乙烯條件下沒有“三重反應”?，F已發(fā)現的實正常成熟(未發(fā)表資料)。說明EIN3的超表達EIN突變體有ein2、ein3、ein4、ein5、ein6、ein7等6可以恢復突變體的成熟性能。種[呵]。其中EIN4編碼一種乙烯受體蛋白。1.2.3 ERFs ERFs ( ethylene-responsive fac-ein2是一種強的乙烯不敏感隱性突變體,導致tors)是-類乙烯反應轉錄因子，它們作用于EIN3植株對乙烯完全不敏感。ein2 突變株可防御由一下游,可以與乙烯調 節(jié)表達基因的啟動子區(qū)的系列病原菌所引起的感染,說明它在乙烯敏感性和GCC( AGCCGCC)框結合,從而引起乙烯反應418]。抗病性中發(fā)揮作用。Alonso 等[17用定位克隆法已對語中國煤化工列和功能研究表明,它分離出EIN2基因。EIN2編碼一個分子量為141們可MYHCNMHG型都具有極為保守的kD的二態(tài)結構的、含1294個氨基酸殘基的多肽。DNA結合區(qū)域,但其酸性調節(jié)區(qū)域的位置具有很含461個氨基酸殘基的N-端是極端疏水性區(qū)域,大差異,從而影響其調節(jié)性能。當酸性調節(jié)區(qū)位于而含833個氨基酸殘基的C端則主要是親水性基5’-端時(Class I ),活化乙烯反應;當酸性調節(jié)區(qū)團。推斷萬市數握白含12個跨膜螺旋區(qū)域(都位位于3'-端時(Class I ),抑制乙烯反應;但當5’端植物生理學通訊第39卷 第5期，2003年10月和3’-端同時具有酸性調節(jié)區(qū)時(Class I),能更強跨膜區(qū),且親水性較強。ERN1的N-端含有一個地活化乙烯反應。據我們在番茄上的研究結果顯多脯氨酸區(qū)段和一段相鄰的甘氨酸殘基鏈(其重復示，在果實成熟前,活化子表達較低,抑制子表達較單元為GGX,X為任一殘基)。其C端含有兩個多強;當果實成熟時,活化子表達增強,抑制子表達迅谷氨酸殘基的酸性區(qū)域和-個富含賴氨酸的堿性速降低;當植物體乙烯信號減弱時,活化子的表達區(qū)域。另外,還推斷ERN1含有數個磷酸化位點，減弱,而抑制子的表達增強(未發(fā)表資料)。這說明磷酸化可以調節(jié)ERN1蛋白的活性。這說明它們的表達受到不同環(huán)境因子和乙烯水平的調節(jié)。ERN1 可能編碼一種核蛋白21]。1.2.4 ERN1蛋白Trentmann等[21]采用mR-此外，研究ERN1在乙烯信號轉導突變體NA差異顯示法,研究擬南芥黃化幼苗乙烯反應途ein3和ctrl中表達的結果證明, ERN1在乙烯信號徑中的轉錄調節(jié)問題時發(fā)現-種新的乙烯調節(jié)的轉導途徑中的表達水平受CTR1和EIN3基因調核定位蛋白,命名為ERN1(ethylene regulated nu-節(jié),說明ERN1作用于EIN3的下游。clear localized protein)。ERN1 是經RNA印跡分2乙烯信號轉導析證明的4個差異表達基因中的一個。在野生型2.1 乙烯信號轉導途徑 即使有些基因沒有從分擬南芥中,ERN1的表達受乙烯的抑制，但在乙烯子水平上得到鑒定,但通過生物化學或突變體間的不敏感型突變體etrl中,乙烯對ERN1的表達無上位性關系分析也可以提供基因產物相互作用順抑制作用。序的信息。研究者們采用上位分析法已構建了乙ERN1克隆無內含子，編碼的蛋白含有407個烯信號轉導途徑中基因作用的構架模型(圖氨基酸殘基,理論分子量為45.9 kD,沒有明顯的1 )[5.11.23]。乙烯反應.ETRIERNI生長.ERSI就芒C2H4”-ERS2-★CTRH-★EIN2-十EIN3 :脅迫ETR2ERFsEIN4脫落成熟圖1乙烯信號轉導途徑的線性關系[由圖1可知,ETR1基因產物是在乙烯信號轉完全清楚乙烯是如何與受體結合的,乙烯受體又是導途徑中最早起作用的。ERS1. ERS2、ETR2、如何把信號傳遞給下游組分的。但通過近年來的EIN4是ETR1的同系物，也編碼乙烯受體蛋白。研究.研究者們提出了一些假設。乙烯信號需與受體蛋白結合后,才能通過CTR12.2.1乙烯與受體結合的可 能機制乙烯 與受體向下傳遞.最后產生乙烯反應。CTR1是信號轉導的結合可能發(fā)生于質膜上。ETR1及其同系物可途徑中的中心組分。另外,ctr1和etr1、ein3、ein4能是金屬蛋白(如含Cu2+ ),乙烯與受體之間是通突變體間的上位性是完全的,且在etr2、ein2和過與蛋白結合的轉運金屬而相互作用,且受體蛋白ein3間的雙重突變體的表型上沒有顯示任何活性,很可能是形成同型或異型二聚體與乙烯結合[23]。這與推斷的乙烯信號線型轉導途徑是- -致的[6]。早在1967年,Burg等[243 就提出，受體與乙烯最近，Whitelaw等122] 發(fā)現,在轉反義LeETR1的結合受一種轉運金屬輔助因子調節(jié)。后來發(fā)現的番茄中,從第1代、第2代和第3代種子所得的在酵母的提取液中恢復ETR1結合乙烯的活性需所有幼苗對乙烯均呈現正常的“三重反應”。有中國煤化TE明上述假說成立。當LeETR2轉錄物在第2代中有輕微的減少,而MYHCNMH G離子在乙烯信號轉導LeETR3(NR)轉錄水平不受影響。由此，中的角色被進一步確定下來。用反義技術抑制Whitelaw等認為乙烯信號是通過平行途徑轉導RAN1基因的表達將導致組成型的乙烯反應,這的。這與擬南芥中推測的途徑是-致的。與受體功能損失所引起的結果一致。RAN1與酵2.2乙 烯信粵慧知和轉導的可能機制迄 今尚不母中的CCC2基因有同源性。CCC2蛋白是一種植物生理學通訊第39 卷第5期，2003年10月551定位在酵母細胞后高爾基體泡囊上的銅離子轉運因子,信號由受體向CTR1傳遞是通過受體的組蛋白,它將銅離子轉運到酵母的膜蛋白上。此發(fā)現氨酸傳遞結構域與CTR1的調節(jié)結構域的相互作表明,植物與酵母一樣同樣也存在著銅離子轉運系用實現的。在無乙烯的條件下,受體/CTR1復合統[1]。乙烯結合區(qū)域的結構模型可能是由與一個體負調節(jié)乙烯反應。因此,乙烯與受體結合后會降銅離子相互結合的跨膜螺旋結構組成的富含電子低ETR1/CTR1復合體的活性,并導致對反應途的疏水袋，其中銅離子直接與乙烯相互作用。徑抑制的去除56.11。而信號在CTR1和EIN3之Bleeker和KendeII認為,受體與乙烯的結合是銅間的轉導需EIN2的參與,但EIN2是通過影響金離子的配位化學鍵改變后,在結合部位引起的構象屬的穩(wěn)態(tài)而間接地作用于乙烯信號,還是作為一種變化能轉導到ETR1二聚體的傳遞結構域上的結功能因子直接作用于乙烯信號,還有待進一步研果。后來一系列轉運金屬的實驗證實,只有銀離子究。Bleecker和Kendel1I指出,EIN2的C-端可能與銅離子有類似的效應,這與這兩種離子的結構相是將乙烯信號向下游組分傳遞的功能區(qū)域,但似性相吻合。因此，在受體上銀離子可代替銅離子:EIN2從受體/CTR1復合體接受信號的機制還不與乙烯結合,但銀離子不能將乙烯信號轉導到下游清楚。EIN3和相關的EIL1和EIL2引起反應途徑組成型激活,從而出現乙烯的生理反應。2.2.2乙烯信號轉導的可 能機制在研究乙烯信此外,Ca2+也是乙烯信號傳遞所必需的32.33]。號向下游組分轉導的過程中發(fā)現,擬南芥的乙烯信這有兩方面的證據,一是Ca2+信使系統的阻斷劑號轉導途徑與酵母滲透信號轉導途徑頗為相抑制了乙烯誘導的特征性反應,如種子萌發(fā)、黃化似5.8.27]。酵母滲透轉導途徑也具有相當于細菌雙幼苗的“三重反應”等;二是依賴Ca2+的蛋白質激組分信號轉導系統的元件以及類似于激酶級聯反酶和蛋白質磷酸酯酶也參與乙烯反應。但對其作應的元件。ETR1蛋白和SLN1蛋白分別在乙烯用機制尚不明了。反應和滲透脅迫反應的早期起作用。SLN1蛋白3展望與ETR1相似，也是信號轉導的組氨酸激酶。另隨著分子生物學和分子遺傳學在植物上的應外,SLN1和ETR1突變分別為編碼MAP級聯激用,已經克隆和鑒定出了許多乙烯信號轉導途徑中酶成員的下游基因的喪失功能性突變所抑制,此下的相關基因(如ETR1、CTR1、EIN2、EIN3等),游基因在乙烯信號轉導途徑中為CTR1(類似于并已基本建立了植物體內乙烯信號轉導途徑的框MAPKKK),在酵母的滲透反應途徑中為PBS2架。以后的研究重點可能在:對這些組分進行更深(類似于MAPKK)和HOG1(類似于MAPK)。在層次的生物化學分析,三維結構與功能的關系及其酵母的滲透反應中,反應調節(jié)器SSK1相當于雙組對生長發(fā)育的調節(jié)過程,信號在細胞內的級聯放大分中的第二個組分,它的磷酸化狀態(tài)受SLN1蛋白和跨入核膜激活靶標基因的過程,乙烯與其它植物的活性所調節(jié)。SSK1 隨后調節(jié)SSK2和SSK22，激素的相互作用方式，從而明確乙烯在植物生長發(fā)后兩者都是蛋白激酶，它們的氨基酸序列與MAP-育中的作用機理。KKK非常相似。SSK2 和SSK22磷酸化PBS2 ,后對乙烯信號轉導途徑的研究,為利用生物技術者又磷酸化HOG1[28]?？刂乒麑嵆墒?、衰老及抗病性研究等具有重要的指根據細菌的信號轉導和酵母的滲透反應途徑導意義。采用生物工程技術控制果實成熟、衰老主可以推測，植物中乙烯信號的傳遞是通過蛋白級聯要有兩種途徑。一是通過控制乙烯的合成，這種磷酸化完成的29]。Chang 等[30] 人又提出乙烯的信方汽中國煤化工射貯藏的轉基因番茄、號轉導是通過蛋白質與蛋白質的相互作用進行的。甜廠YHC NMH G希信號的轉導，即降低最近,Novikova等[31] 指出在乙烯信號轉導途徑果蔬對乙烯的敏感性,從而抑制果實的成熟和衰中,MAP級聯激酶的作用還有GTP結合蛋白的老。同時可以通過調節(jié)乙烯的信號轉導增強果蔬參與。的抗病性。相信今后隨著乙烯信號轉導途徑的逐在乙孺宿麴轉導途徑中,乙烯受體作為負調節(jié)步明確,必將為控制果蔬的成熟和衰老以及增強抗552植物生理學通訊第39卷 第5期，2003年10月病性提供更多可操作的基因位點和控制方法。18 Ohme- Takagi M, Shinshi H. 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