化學(xué)與生物工程2015,V,32№.07Www.hxyswgc.comChemistry Bioengineeringdoi:10.3969/j.issn.l672-5425.2015.07.018燃料乙醇生產(chǎn)中低聚糖及有機(jī)酸的HPLC分析及應(yīng)用效果鄭偉,楊維旭,李冬梅,譚洪波,劉春景,孔令新(吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司,吉林吉林132101)摘要:在燃料乙醇生產(chǎn)過(guò)程中,采用高效液相色譜(HPLC)對(duì)低聚糖及有機(jī)酸進(jìn)行監(jiān)測(cè);探討了HPLC法的跟蹤效果,并對(duì)有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行了分析。結(jié)果衷明:對(duì)發(fā)酵液開(kāi)展HPLC檢測(cè),在生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及決策上效果理想,可滿(mǎn)足過(guò)程監(jiān)控的需求。關(guān)鍵詞:燃料乙醇;低聚糖;有機(jī)酸;發(fā)酵液;糖化酶;酵母;染菌中圖分類(lèi)號(hào):TQ9230657.72文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1672-5425(2015)07-0067-04在燃料乙醇的生產(chǎn)中,成熟的發(fā)酵技術(shù)就是嚴(yán)格菌對(duì)酵母產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)性抑制上,效果較為理想,為生產(chǎn)的過(guò)程控制,體現(xiàn)的是從低聚糖到發(fā)酵產(chǎn)物并形成有工藝的優(yōu)化及決策提供了更為科學(xué)的數(shù)據(jù)依據(jù)。機(jī)酸的過(guò)程,而過(guò)程控制的實(shí)現(xiàn),需要對(duì)過(guò)程參數(shù)進(jìn)行合理選取和有效監(jiān)測(cè)。其中低聚糖及有機(jī)酸的監(jiān)測(cè)是1實(shí)驗(yàn)掌握生產(chǎn)中通過(guò)酵母的發(fā)酵將糖轉(zhuǎn)化為乙醇的必備手1.1試劑及儀器段;組分能夠被及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè),可充分表達(dá)發(fā)酵工麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖、乳酸鋰、丙三醇、醋酸序運(yùn)行狀態(tài),對(duì)避免染菌、使乙醇收率最大化起到指導(dǎo)鈉、無(wú)水硫酸鈉、乙醇,均為色譜純, Sigma Aldrich化性作用。學(xué)公司2。在燃料乙醇的生產(chǎn)上,國(guó)內(nèi)仍沿續(xù)著常規(guī)的化學(xué)Lexar LC10系統(tǒng), Perkin Elmer公司,軟件方法監(jiān)測(cè)工藝過(guò)程,對(duì)發(fā)酵工藝指標(biāo)還局限在還原糖、 Chromera Manager Ver4.1.0.6386, phenomenex揮發(fā)酸殘總糖的層面上,而國(guó)外(如美國(guó) Corn Plus REZEXM ROA Organic Acid色譜柱(300mm×7.8及 Renew Energy燃料乙醇公司)已采用高效液相色mm,8gm),AJO4490預(yù)處理柱(50mm×7.8mm,譜(HPLC)法分析,是對(duì)發(fā)酵過(guò)程更為精細(xì)化和最為8m)。直接的分析方法;通過(guò)測(cè)定低聚糖[DP(低聚糖4-101.2方法糖)、麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖]、有機(jī)酸、醇(乳酸和丙1.2.1低聚糖及有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度三醇、醋酸)、發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物(乙醇)等含量,可非常直觀分別準(zhǔn)確稱(chēng)取8種標(biāo)準(zhǔn)品置于100mL容量瓶地表達(dá)工藝中各罐的發(fā)酵狀況,最終確定工藝參數(shù)。中,用流動(dòng)相(0.0025mol·L-1H2SO4)溶解并定容,這些精細(xì)化指標(biāo)對(duì)工藝的運(yùn)行條件更為具體實(shí)用,這配制成標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液及混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液;混合標(biāo)準(zhǔn)不僅僅是檢測(cè)儀器或分析方法的提升,更是對(duì)生產(chǎn)品溶液濃度見(jiàn)表1。藝管理的促進(jìn)。1.2.2樣品預(yù)處理吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司質(zhì)檢中心自2004年為避免酶解及發(fā)酵的持續(xù)進(jìn)行,需檢測(cè)發(fā)酵醪液起,參照 Cerestar、 Corn Plus及 Renew Energy公司的的初始pH值。用65%H2SO、將醪液pH值調(diào)至1.0檢測(cè)方法,對(duì)發(fā)酵醪液開(kāi)展了HPLC的全程監(jiān)測(cè),在1.5,4000r·min-1離心5min。取上清液50mL,合理控制糖化酶用量、發(fā)酵溫度,避免酵母抑制以及染定容到100mL,0.22pm水系濾頭過(guò)濾至色譜樣品瓶收稿日期:2015-0305作者簡(jiǎn)介:鄭偉(1965-),女,吉林省吉林市人,碩士,高級(jí)工程師,主要從事燃料t H中國(guó)煤化工wjfa@cnpc.comcn;通訊作者:楊維旭,高級(jí)工程師,Emal:yangwx.jfa@cnpc.com.cnCNMHG鄭偉等:燃料乙醇生產(chǎn)中低聚糖及有機(jī)酸的HPLC分析及應(yīng)用效果/2015正鼻7用表1低聚糖及有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.2.3色譜條件濃度/g·(100mL)-1]流動(dòng)相為0.0025mol·LH2SO4,流速0.6mLTab. 1 Concentration of oligosaccharides and organic·min1,柱箱溫度65℃,RID溫度50C,進(jìn)樣量20acid mixed standard solutionL,運(yùn)行時(shí)間25min樣品名稱(chēng)濃度樣品名稱(chēng)濃度1.2.4低聚糖及有機(jī)酸定性、定量方法無(wú)水硫酸鈉乳酸鋰先以保留時(shí)間、樣品加標(biāo)來(lái)進(jìn)行定性;再以峰面積麥芽三糖丙三醇外標(biāo)法定量。麥芽糖醋酸鈉葡萄糖乙醇2結(jié)果與討論注:定量時(shí)將無(wú)水硫酸鈉的量乘以0.8即為DP的量。2.1低聚糖及有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和線性范中,自動(dòng)進(jìn)樣,進(jìn)行HPLC分析。圍(表2)表2混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的回歸方程和線性范圍Tab 2Regression equation and linear range of mixed standard solution回歸方程相關(guān)系數(shù)線性范圍樣品名稱(chēng)截距Y斜率Xg·(100mL)-11.88384e+0023.109764e+0030.9996162.732~16.620麥芽三糖3.20229e+0003.768599e+0030.9972520.476~0.953麥芽糖5.727923e+0012.85678le+0030.9997691.075~5.957葡萄糖1.097297e+0022.935999e+0030.9999303.35~10.93乳酸2.554407e+0012.073031e+0030.9958180.10~0.583.982963e+0012.277596e+0030.9996910.52~1.56醋酸4.502039e+0011.629429e+0030.996860乙醇3.001877e+00l1.225771e+0030.9999982.05~15.502.2燃料乙醇生產(chǎn)中發(fā)酵液的液相色譜(圖1)聯(lián)合作用下異構(gòu)生成。發(fā)酵液中重點(diǎn)關(guān)注的組分DP(低聚糖4-10糖,合峰)、麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖、乳酸、丙三醇、醋酸、乙醇2.3HPLC對(duì)發(fā)酵過(guò)程的跟蹤應(yīng)用首先,在發(fā)酵早期監(jiān)控DP分布,可讓工藝人員0.75了解淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的程度,并確定投0.502MA八酵母的具體時(shí)間。其次,后面出峰的組分(乳酸、丙三醇、醋酸和乙醇)代表在發(fā)酵期間所產(chǎn)生的有機(jī)酸和乙0.02.55.07.510.012.515.017.520022.5醇。監(jiān)控這些組分,可便于工藝人員確認(rèn)發(fā)酵終點(diǎn);并圖1發(fā)酵液的HPLC圖譜指導(dǎo)工藝人員添加嚴(yán)格控制的限量抗生素,來(lái)抑制細(xì)Fig. 1 HPLC Spectrum of fermentation liquid菌的污染,及防止其它可能導(dǎo)致抑制乙醇生產(chǎn)的情況由圖1、表2可知,發(fā)酵液中各組分分離度較好,發(fā)生含量線性范圍涵蓋合理,相關(guān)性較高滿(mǎn)足方法的適用2.3.1理想的發(fā)酵狀態(tài)性要求。利用HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程,理想的發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表在對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行HPLC分析時(shí),組分中會(huì)分離出其它的發(fā)酵產(chǎn)物;其中,阿拉伯糖、丁二酸、甲醇系發(fā)酵在進(jìn)行HPLC分析的同時(shí),將HPIC的分析結(jié)果過(guò)程中正常產(chǎn)物,對(duì)發(fā)酵影響不大;果糖系液化過(guò)程中同發(fā)酵溫度H中國(guó)煤化工奉相結(jié)合,對(duì)燃料淀粉鏈還原端的一些葡萄糖單元在高pH值和高溫的乙醇生產(chǎn)具CNMHG鄭偉等:燃料乙醇生產(chǎn)中低聚糖及有機(jī)酸的HPLC分析及應(yīng)用效果/2015正■7睏表3理想的發(fā)酵結(jié)果Tab. 3Data of ideal fermentation發(fā)酵時(shí)間溫度濃度/g·(100mL)1乙醇體積分?jǐn)?shù)hC“胞數(shù)出芽率DP麥芽三糖麥芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇2080.8075.8760.0430.0141.863.42360.5748.4590.0720.0143.143.892233.52146.460.1801.196.1140.0761.280.0197.4833.42490.2493.7240.0921.330.03010.380.1320.450.0930.03212.9015.9933.30.740.0900.420.1110.0951.400.04313.4416.662.3.2有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表4~7。利用HPLC對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行跟蹤分析,有問(wèn)題的1)糖化酶用量表4有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果1Tab 4Problem fermentation data 1發(fā)酵時(shí)間溫度濃度/[g·(100mL)-1乙醇體積分?jǐn)?shù)麥芽三糖麥芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇%5.8760.0430.01433.2152,850.0890.0251.912.372233.312.941.843.031.420.0950.0313.844.76分析表4結(jié)果可知,發(fā)酵過(guò)程存在的問(wèn)題為較高是發(fā)酵過(guò)程中糖化酶添加量不足。因此,在發(fā)酵罐中的DP值、較高的葡萄糖值、乙醇產(chǎn)率低。原因可能應(yīng)再添加一些糖化酶。表5有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果2Tab. 5Problem fermentation data 2發(fā)酵時(shí)間出芽率濃度/[g·(100mL)1乙醇體積分?jǐn)?shù)活細(xì)胞數(shù)%DP麥芽三糖麥芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇937.720.8075.425.8760.0430.670.0141.862.300.71013.5700.0721.020.0144.480.3801.8910.8400.1901.410.0247.599.4132l85831.230.1900.806.8900.3401.500.0419.1011.28分析表5結(jié)果可知,發(fā)酵過(guò)程存在的問(wèn)題為較快多,較高的葡萄糖濃度造成對(duì)酵母的滲透壓過(guò)高。因的DP水解速度、早期有較高的葡萄糖數(shù)值、較高的此,應(yīng)減少糖化酶的用量。丙三醇和有機(jī)酸數(shù)值。原因可能是添加的糖化酶過(guò)2)發(fā)酵溫度有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果Tab. 6Problem fermentation data 3發(fā)酵時(shí)間溫度C胞數(shù)出芽率濃度g·(100mL)-1乙醇體積分?jǐn)?shù)%DP麥芽三糖芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇32.22017.726.9120.043790.0141.121.768.940.5443.799.5600.0970.980.0202.643.2735.62140,1701.19H8.360中國(guó)煤化工7,18CNMHG鄭偉等:燃料乙醇生產(chǎn)中低聚糖及有機(jī)酸的HPLC分析及應(yīng)用效果/2015年鼻7廂分析表6結(jié)果可知,發(fā)酵過(guò)程存在的問(wèn)題為較高率和活細(xì)胞數(shù)。原因可能是發(fā)酵溫度過(guò)高造成酵母生的發(fā)酵溫度、較慢的酵母利用葡萄糖的速率、較高的丙長(zhǎng)受抑制。因此,應(yīng)采用較低的發(fā)酵溫度32~33℃。三醇數(shù)值、低的乙醇產(chǎn)率、較高的有機(jī)酸、較低的出芽3)染菌表7有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果4Tab. 7Problem fermentation data 4發(fā)酵時(shí)間出芽率濃度/[g·(100mL)-1]乙醇體積分?jǐn)?shù)活細(xì)胞數(shù)h麥芽三糖麥芽糖葡萄糖乳酸丙三醇醋酸乙醇2087.720.8075.425.8760.2500.670.0291.862.300.5743.798.4590.1200.910.0192.842140.1801.196.9100.1701.440.0355.60199882.280.2490.434.9600.3901.550.0487.949.85分析表7結(jié)果可知,發(fā)酵過(guò)程存在的問(wèn)題為較慢淀粉在整個(gè)乙醇生產(chǎn)工藝的水解程度和水解產(chǎn)物特的葡萄糖利用效率、較高的有機(jī)酸、較低的乙醇產(chǎn)率、性,能更直觀地表達(dá)發(fā)酵過(guò)程中各罐的發(fā)酵狀況;為掌較低的出芽率和活細(xì)胞數(shù)。原因可能是染菌造成對(duì)酵握酶作用底物效果,酵母的充分利用等生產(chǎn)運(yùn)行狀態(tài),母的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。因此,在酵母培養(yǎng)和發(fā)酵罐中應(yīng)添確定合理工藝參數(shù),避免罐內(nèi)物料染菌,提高轉(zhuǎn)化率,加抑菌劑可以起到很好作用效果,是生產(chǎn)、工藝管理者及操作者3結(jié)語(yǔ)理想的控制資料和數(shù)據(jù),具有重要的指導(dǎo)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義1)通過(guò)HPLC法對(duì)燃料乙醇生產(chǎn)中的發(fā)酵液進(jìn)參考文獻(xiàn):行低聚糖及有機(jī)酸的檢測(cè)分析,是過(guò)程控制的最為有1 MCGINLEY M,MOTT. Ethanol Production Monitoring Using效的手段,其多組分分離的方法直觀、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)lon Exclusion hplc.2]楊毅,李崎,陳蘊(yùn),等.反相高效液相色譜法(RP·HPLC)測(cè)定啤酒確;為生產(chǎn)裝置平穩(wěn)運(yùn)行提供了準(zhǔn)確數(shù)據(jù)信息,實(shí)現(xiàn)了中有機(jī)酸[門(mén)].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(8):6-12.過(guò)程質(zhì)量管理及控制的動(dòng)態(tài)分析。[3]劉文信.HPLC在酒精發(fā)酵醪液檢測(cè)中的應(yīng)用[J].化學(xué)工程師2)依據(jù)HPLC檢測(cè)發(fā)酵不同時(shí)間段數(shù)據(jù)的累積013,(2):28-30可有效掌握液化糖化工序、酶作用底物的效果,了解HPLC Analysis and Application Effect of Oligosaccharides andOrganic Acid in the production of Fuel ethanoZHENG Wei, YANG Wei-xu, LI Dong-mei, TAN Hong-bo, LIU Chun-jing, KONG Ling-xin(ilin Fuel Alcohol Com pany Limited, Jilin 132101, China)Abstract: The content of oligosaccharide and organic acid in the production process of fuel ethanol was de-termined by high performance liquid chromatography(HPLC). The tracking effect of hPlc was discussed, andthe problem of fermentation data were analyzed. The results showed that, HPLC analysis of fermentation liquidwas ideal in the production process optimization and decision making, and met the requirements of process moniKeywords: fuel ethanol; oligosaccharides; organic acid; fermentation liquid; saccharifying enzyme; yeast: bac-terial contamination中國(guó)煤化工CNMHG