淡水漁業(yè)》1998年第28卷第2期用于RAPD分析的魚類血樣乙醇保存方法的研究張德春楊代淑李曉迎張錫元’余來寧方耀林(武漢大學生命科學院,武漢43002)(長江水產研究所,荊州43400摘要從乙醇保存的白鰱血液中提取基因組DNA,經瓊脂糖凝膠電泳分析的紫外檢測表明:其大小和純度與冷凍保存的白鰱血液提取的基因組DNA相當。以從乙醇保存和冷凍保存的同一條白鰱血細胞提取的基因組DNA為模板,用4種隨機引物分別進行RAP擴增,結果顯示兩種保存方法獲取的基因組DNMA的每一種引物所擴增的帶型都相同關健詞魚類,基因組DNA,RAPD隨機擴增多態(tài)DNA( Rondon Amplified是野外采集)中常用的冷凍保存樣品的方法lymorphic DNA,RAPD)技術是1990年由不僅麻煩,而且還受各種條件的限制,保存Wiliams等和Wlsh等兩個小組同時建立發(fā)的時間也不宜過長。針對采樣和實驗的需展起來的,它具有以下優(yōu)點:(1)技術比較要,我們研究了用乙醇保存魚類血樣提取合簡單,無需制備克隆、同位素標記和分子雜乎要求的基因組DNA的方法,用于RAPD交等;(2)靈敏度高,可提供足夠豐富的多分析,取得了滿意的效果。態(tài)性;(3)對模板DNA純度要求不高;(4)1材料和方法成本較低。RAPD技術產生的時間不長,但1.1材料白鰱購自武漢市水果湖市場該技術已廣泛應用于生物領域的各個方面。2材料處理活魚經尾靜脈取血,血液提取魚類基因組DNA常用組織多為肝中加入1/6體積的ACD抗凝劑(0.48%檸檬臟、肌肉、生殖腺等,取血樣提DNA的方酸,0.32%檸檬酸鈉,1.47%葡萄糖),混法較少使用。我們已作的研究證明,以魚類勻。一部分血液-20℃保存;一部分血液加的血細胞作為提取基因組DNA的材料可以人無水乙醇至終濃度為70%,混勻,靜置,不傷害魚本身,并由于魚類外周血細胞有分散的血細胞顆粒沉降下來,室溫放置核,在介質中處于分散狀態(tài),去除蛋白質和1.3基因組DNA的提取RNA比較容易,花費較少就能獲得純度較1.3.1乙醇保存血液的基因組DNA的提取高的DNA,表明這一方法具有很大的優(yōu)越取200u血細胞顆粒乙醇懸濁液于1只性(另文發(fā)表)。但是,在采集標本(特別1.5 ml Eppendorf管中。3.500×g離心3min,本工作得到國家自然科學基金(3960582)的資助+聯(lián)系人稿日期:997-11-18。沉淀用lm0.8%Nac懸浮沉淀,重復45每個循環(huán)包括94℃變性40S,36℃退火505次。沉淀加入10010.8%Nad懸浮,再加入72℃延伸1.%min。首次循環(huán)前于94℃預變400 hul dnA抽提緩沖液(10mmo/ L Tris-HC,性5min,最后一個循環(huán)后于72℃延伸5min00m/LEDA,0.5%Ss,p8.0),加擴增片段用1.2%瓊脂糖凝膠(含0.5ug/ml蛋白酶K至終濃度為10ug/m,55℃消化溴化釔)電泳1.5h(sVcm),紫外燈下觀4-6h。用等體積酚/氣仿/異戊醇(25/24/察拍照l)抽提。離心后上清用2倍體積預冷的無2結果水乙醇沉積DNA。用70%乙醇洗滌DNA沉2.1基因組DNA的電泳圖譜(圖略去)淀2次后,將DNA空氣干燥,用適量TE2.2基因組DNA的紫外吸收lOmmol/L Tris-HCL, ImmoL/L, EDTA測定冷凍保存血液和乙醇保存血液提取pH8.0)溶解,并調整DNA濃度至大約的基因組DNA的紫外吸收,其Axo/A>o值25ng/山,4℃保存。分別為178和1.76,均大于17513.2冷凍保存血液的基因組DNA提取23,基因組DNA的RAPD擴增結果冷凍血液室溫融解,取100udl于F分別用OPM-9,OPM-10,OPM13endorf中,加人1m0.8%,Nad,混勻,離OM-19(0 peron Technologies公司出品)四心,乳白色沉淀用100ul0.8%Nal懸浮,再種引物對冷凍保存和乙醇保存血液提取的基加人400dDNA抽提緩沖液,加蛋白酶K至因組DNA進行擴增。四種引物在兩組基因終濃度(80y/m),55℃消化2-4h后,抽組DNA中都得到了相同的擴增效果。提。DNA沉淀洗滌后溶于TE,調整濃度至3討論25g/d左右,4℃保存。基因組DNA的質量與RAPD的擴增效14冷凍保存血液和乙醇保存血液的基因果直接有關。在我們這項實驗中中,乙醇保DNA的瓊脂糖凝膠電泳及紫外吸收的測定存血液所提取的基因組和冷凍保存血液提取1.4.1瓊脂糖凝膠電泳的基因組DNA的片段大小一致,沒有RNA采用07%瓊脂糖凝膠(含0.5/m溴污染;兩組基因組DNA的Ao/Ax值均大化釔錠)電泳lh(5v/(cm),紫外燈下觀察于175,表明DNA樣品中沒有顯著的蛋白拍照。質污染,適于RAPD分析。乙醇保存血液和1.4.2紫外吸收的測定冷凍保存血液提取的基因組DNA在其它條在波長260m、280mm下測定基因組件相同的情況下,對同一種引物擴增的譜帶DNA的紫外吸收。是相同的,說明用乙醇保存魚類血樣不會影.5RAPD分析響RAPD分析的擴增效果,但在野外用乙醉在其它條件相同的情況下,分別以冷凍保存血樣和冷凍保存血樣相比,具有明顯的保存血樣和乙醇保存血樣所提取的基因組優(yōu)點:(1)方便、簡單、便于攜帶。冷凍保DNA為模板,進行RAPD擴增。RAPD反應存血樣比較麻煩,而用乙醇保存則十分方總體積為25,含10mml/ L Tris-BC;便,有利于野外大量樣品的采集;(2)可較pH83;50mLKl;3/omm/LM2;長時間保存樣品;(3)成本低。000明膠;20umo/ L dNTPs;0.24um/L冷凍保存血液室溫融解后,大部分細胞引物;25 ngDNA模板和15單位 Taq dNA聚膜已破,細胞質中的大量蛋白質經離心而除合物(華美生物工程公司)。反應混合物覆去,沉淀主要在細胞核,蛋白質含量較少,蓋一層石蠟油。反應過程包括45個循環(huán),用少量蛋白酶K吧/ml)在較短時間(24h)內就能徹底消化,所需酚抽提的次數(shù)也(48h),同時,需要多次酚抽提才能充分很少。用乙醇保存血液提取DNA時,首先除掉蛋白質。要充分除去乙醇,否則將影響蛋白合乎K綜上所述,乙醇保存血液提取的基因組的作用;由于細胞質中的蛋白質在加入DNA的質量及RAPD擴增效果和冷凍保存血DNA抽提緩沖診前沒有除去,并由于乙醇液提取的基因組DNA是一致的,這為野外的作用而凝縮變性,因而消化所需蛋白酶K采集樣品提供了一個簡單、方便的途徑要多些(200g/ml),消化時間也要長些優(yōu)質魚苗魚種廣州龍歸魚苗場為您提供1.臺灣單雄性吳郭魚2.奧尼羅非魚3.珍珠粒花鯛(紅色羅非魚)4.淡水白鯧5.美國叉尾鮮6.大口鯰、鱖魚、加州鱸、彭澤鯽、本地胡子鯰等苗類魚苗品質純正價格優(yōu)惠,歡迎各地朋友來人來電或來函洽談購買,我們熱誠為客戶提供一切便利服場址:廣州市白云區(qū)龍歸鎮(zhèn)南嶺郵編:510445場長:戴惠田電話:(020)86269121392325970神礦速南藍華業(yè)青公司a就羅非、頸水白■到菌海南勝華漁業(yè)有限公司是海南島內從事于魚苗魚種生產和研究的專業(yè)化漁業(yè)公空司,一直以“客戶至上,質量取勝”為宗旨,以求實、高效的作風與全國廣大的戶保持長期穩(wěn)定良好的合作,每年提供奧尼羅非魚(雄性率85%以上),淡水白纟王等魚苗魚種90多萬尾。同時,獨家代理海南(臺灣)益華水產公司繁殖的單性羅非魚苗魚種(雄性率%5%以上)。在新的一年里,我們將一如繼往地為廣大客戶提供質優(yōu)價廉的魚苗魚種和良好的服務,真誠歡迎廣大客戶蒞臨現(xiàn)場參觀指導公司地址:海南省海口市白沙門下村57號聯(lián)系人:任小姐、舒小姐電話;(0898)6275684郵編:5708B機(中文):(081891-38936手機:(0)1397562650)1397564295開戶行:海南省?？谑泻Ｂ?lián)信用社海甸分社帳號:201|-1042