廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)2011 年增刊，72不同添加劑對花生誘導(dǎo)分化的影響溫世杰'，童彩群2,羅虹， 梁炫強(qiáng)'(1.廣東省農(nóng)科院作物研究所，廣東廣州510640; 2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510631)摘要:以花生 7日齡幼葉、胚軸和子葉為外植體,比較了其離體培養(yǎng)獲得再生植株的能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),7日齡幼葉具有良好的誘導(dǎo)分化能力。而在其誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的乙酰丁香酮(AS)、AgNO3和谷氨酰胺(GIn),比較各添加劑對花生誘導(dǎo)分化的影響,結(jié)果表明,AS為40mg/L時(shí),誘導(dǎo)效果最佳,達(dá)93.08%;AgNO,濃度為1mg/L時(shí),誘導(dǎo)率為90.63%。該研究結(jié)果為將來花生轉(zhuǎn)基因研究提供依據(jù)。關(guān)鍵詞:花生;組織培養(yǎng);分化中圄分類號:565.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號:1004-874X(2011)25- -0072 -03Effect of different additives on peanut(Arachishypogaea L. )explants differentiationWEN Shi-jie', TONG Cai-qun', LUO Hong', LIANG Xuan- qiang'(1.Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agicultural Sciences, Guangzhou 510640, China;2.College of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)Abstract:The paper studied the better ability of differentiation on peanut explants, which were cut from the lealets,embryonic axes and cotyledons of 7-day -old seedlings. The results showed that the leaflets were better. To study the efectof different additives on the leaflets of 7 -day -old seedlings for the transgenimc of peanut in the future, differentconcentrations of AS, AgNO3 and CIn were added in the inductive medium. The results showed the medium supplement 40mg/L AS was the best, induction frequency of callus was 93.08%, and the medium supplement 1 mg/L AgNO3 was 90.63%.Key words: peanut(Arachis hypogaea L);plant regeneration diflerentiation花生(ArachishypogaeaL.)是我國主要油料作物1材料與方法和經(jīng)濟(jì)作物之--。花生組織培養(yǎng)作為生物技術(shù)育種的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其再生效率是研究人員最重視的指1.1試驗(yàn)材料標(biāo)"。近年來雖然有不少以花生屬植物的成熟胚、未成供試花生品種為廣東省農(nóng)科院作物研究所培育的熟胚凹、子葉節(jié)田、子葉圖、胚軸5、幼葉16-7、 胚小葉8甚至珍珠紅- -號。胚中段為外植物體的離體培養(yǎng)獲得再生植株的報(bào)道,1.2 試驗(yàn)方法但是花生外植體再生效率，不僅與激素的種類和外植1.2.1外植體獲取 花生 去殼后用蒸餾水沖洗3次,浸體有關(guān),而且品種間也存在較大的差異。本試驗(yàn)基于前泡30 min。在超凈工作臺(tái)上用75%酒精消毒30s,無菌期的工作基礎(chǔ)，對花生離體培養(yǎng)添加不同的外源添加水沖洗1~2次,0.1%(W/V)HgCl2消毒10 min,無菌水劑,探討其對花生誘導(dǎo)分化的影響，為根癌農(nóng)桿菌途徑?jīng)_洗4~5次,用經(jīng)滅菌的吸水紙吸去多余水分,接種至轉(zhuǎn)化的花生轉(zhuǎn)基因研究提供依據(jù)。1/2MS培養(yǎng)基上,25(+1)C下培養(yǎng)。7d左右,第1對真葉從子葉中伸出,切取未打開的葉片作為外植體。收稿日期:2011-11-15基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(30971819 ,30900907);國家1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)前期基本確定了最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(nyeyta-19);廣東省自然科學(xué)(MSY)組成為:MS+10 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,培基金(10151064001000002 ,91510010000001);粵港關(guān)鍵領(lǐng)域養(yǎng)基的蔗糖濃度為3.0%,pH值為5.8,1219C高壓滅菌重點(diǎn)突破項(xiàng)目(2008A024200009)20min。以MSY為對照,加入不同濃度的乙酰丁香酮作者簡介:溫世杰(1983-),男,研究實(shí)習(xí)員,E-mail:wenshiie(AS) AgNO3中國煤化工建及方法見表1。1983@163.com培養(yǎng)條件為::MHCNMHGh/d,光照強(qiáng)度通訊作者:梁炫強(qiáng)(1964-),男,博士,研究員,E -mail:Liang8044 000 lx。@yahoo.com73表1幾種添加劑的添加濃度與方法添加劑添加劑濃度(mg/L)添加方法.無(對照組)AS2:在MS培養(yǎng)基高溫滅菌冷卻至60C后按比例添加AS4(AgNO3在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基滅菌冷卻至60C后按比例添加AgNO3Gln在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基滅菌冷卻至60C后按比例添加Gln基、相同的培養(yǎng)條件下,誘導(dǎo)的愈傷組織有差異,詳見2結(jié)果與分析表2。7日齡子葉或胚軸組織產(chǎn)生的結(jié)實(shí)球狀愈傷組2.1不同外植體的再生能力織的分化能力較差,而7日齡幼片愈傷組織狀態(tài)最佳，如圖1(彩插四)所示,不同的外植體在MSY培養(yǎng)出芽狀況最好，芽誘導(dǎo)率約為85%。因此以珍珠紅1A:7日齡花生幼葉長出的愈傷組織;B:7日齡子葉長出的愈傷組織;C:7日齡胚軸長出的愈傷組織圖1不同花生外植體的誘導(dǎo)情況表2不同花生外植體的再生能力比較外植體類型切取部位及方法愈傷組織、芽的形態(tài)與質(zhì)地芽誘導(dǎo)率7日齡幼葉 取下幼葉,切去四周的一圈，2~3d后葉片開始展開,7d左右傷口開始膨大，邊緣開始出現(xiàn)黃綠色的愈切成0.2cmx0.5cm的小片傷組織,2周后可以看到在愈傷組織上有芽點(diǎn)或新的白色愈傷組織出現(xiàn)7日齡子葉取子葉 中部約0.5cm子葉切口邊緣出現(xiàn)很多球狀結(jié)實(shí)的愈傷組織，但分化特別慢,2個(gè)月后葉未分化出芽片的愈傷組織再生出小苗,子葉仍然是愈傷組織狀態(tài)7日齡胚軸取靠近子葉的胚軸0.5cm胚軸產(chǎn)生的愈傷組織皆為白色絮狀組織,沒有分化能力,且切口分泌物質(zhì)未分化出芽較多,呈褐色號的7日齡幼葉作為外植體較為合適。導(dǎo)率達(dá)90.63%,而提高AgNO3濃度至2 mg/L時(shí),誘2.2不同添加劑對花生愈傷組織誘導(dǎo)率的影響導(dǎo)率反而下降到6.9%。當(dāng)添加2 mg/L Gln時(shí),誘不同添加劑(AS、AgNO3GIn)對花生愈傷組織誘導(dǎo)率為87.91%，當(dāng)增加Gln的濃度至6 mg/L時(shí),誘導(dǎo)率的影響結(jié)果見表3。幾種外源添加劑均能有效導(dǎo)率下降到63.11%。提高花生愈傷組織誘導(dǎo)率,在MSY培養(yǎng)基中添加403結(jié)論與中國煤化工mg/L的AS誘導(dǎo)效果最佳。當(dāng)逐漸加大AgNO3和GIn的濃度時(shí)，對誘導(dǎo)愈傷組織是不利的。外植體對外植體YHCN M HC植物組織培養(yǎng)的AgNO3反應(yīng)極為明顯，當(dāng)添加1 mg/L AgNO3時(shí),誘三大要素,本研究結(jié)果表明,選用7日齡幼葉為外植體74表3不同添加劑對 花生愈傷誘導(dǎo)率的影響添加物濃度愈傷組織誘導(dǎo)率添加物愈傷組織質(zhì)地與大小的差異(mg/L)(%)無(對照組)白色絮狀或黃綠色結(jié)實(shí)塊狀，量較少57.89AS25白色絮狀或黃綠色結(jié)實(shí)塊狀，分布在切口四周,愈傷組織量多,且多為白色85.941093.08AgNO3白色絮狀,中間夾帶點(diǎn)褐色,愈傷組織量較多,分布于切口四周90.63白色絮狀,少有黃綠色塊狀,只在切口的某一處長出一點(diǎn)66.99Cln白色絮狀或黃綠色結(jié)實(shí)塊狀分布在切口四周,愈傷組織量較多87.9184.4463.11具有良好的誘導(dǎo)效果。在植物組織離體培養(yǎng)過程中,容3] DENG Xiang yang,ZHI Ming wei,HAI Long an.Transgenic易產(chǎn)生乙烯并逐漸積累，而乙烯的積累使得外植體分peanut plants obtained by particle bombardment via化受到影響或毒害。Ag*是一種較好的乙烯活性抑制somatic embryogenesis regeneration system[J].Cell Research,2001,11(2): 156-160.劑,培養(yǎng)基中添加AgNO3能有效地抑制乙烯形成,減4] Swathi Anuradha T,Jami S K,Dala R S,et al.Genetic少或消除乙烯對細(xì)胞生長的不利影響。有學(xué)者指出transformation of peanut(Arachis hypogaea L. )usingAgNO3是競爭性地作用于乙烯作用部分從而促進(jìn)器官cotyledonary node as explant and a promoterless gus :nptII發(fā)生,提高細(xì)胞的再生能力心。AgNO,對花生離體培養(yǎng)fusion gene based vector[J]J. Biosci, 2006 ,31(2):235- -246.有明顯的作用,但是不同外植體源對AgNO3促進(jìn)器官5] Kiran K S,Vanamala A. An eficient method for the發(fā)生和產(chǎn)生毒害的劑量存在差異叫。谷氨酰胺(GIn)是production of transgenic plants of peanut (Arachis hypogueaL. )through Agrobacterium tumefaciens -mediated genetic tran-合成生物體內(nèi)極其重要的抗氧化劑一還 原型谷胱甘sformation[J].Plant Science 2000,159:7-19.肽(reduced glutathione ,GSH)的前體物質(zhì)叼，是構(gòu)成蛋6] 林榮雙,梁麗琨.花生成熟胚胚軸的植株再生和快繁[]生物白質(zhì)中氨基酸和合成含氨生物物質(zhì)的氮源，與組織生技術(shù),2003, 13(1):29- -31.長和修補(bǔ)有密切的關(guān)系，在生命活動(dòng)中起重要作用31。7]李艷,李少雄,周桂元,等.花生幼葉叢生芽的誘導(dǎo)和高效再研究表明加人適當(dāng)濃度的Gln對外植體的褐化現(xiàn)象有生體系的建立[].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2006(7): 14-16.抑制作用，但是不同外植體對其作用的最佳濃度也有8]莊東紅,周敏,鄭奕雄花生幼葉芽誘導(dǎo)和植株再生研究[].中國油料作物學(xué)報(bào),2001 ,23(3):13-15.差異。從本試驗(yàn)結(jié)果來看,當(dāng)添加1 mg/L AgNO3或29]溫世杰,劉海燕,梁炫強(qiáng).胚中段為外植體的花生高效再生mg/LGln時(shí),花生外植體誘導(dǎo)分化的效果較佳,愈傷組體系構(gòu)建研究[J].花生學(xué)報(bào),2010,39(2):29 -32.織誘導(dǎo)率分別為90.63%和87.91%;在添加40 mg/L[10]張鵬,傅愛根.AgNO3在植物離體培養(yǎng)中的作用及可能的機(jī)AS時(shí),可以達(dá)到最佳的誘導(dǎo)效果,這可為花生轉(zhuǎn)基因制[].植物生理學(xué)通訊, 1997 ,3():376- 379.研究提供參考。[1]周蓉,陳小媚.AgNO3對花生離體培養(yǎng)芽再生的作用[].花生科技, 99(S):257 -260.參考文獻(xiàn):[12] Harward T R,Coe D,Souba W W. Glutamine1] 方小平,許澤義,張宗義,等.花生小葉外植體植株再生及農(nóng)gutdlutathione levels during intestinal ischemika reperfusion桿菌介導(dǎo)的基因遺傳轉(zhuǎn)化[J].中國油料,1996,18(4):52-56.IJ Surg Res, 1994,56:351-354.2] Ihson I,Robina S,Mussarat J Plantlet regeneration from[13]陸維瑋,沈亞領(lǐng),王樹力.谷氨酰胺的研究及開發(fā)進(jìn)展[].中mature embryos of peanut (Arachis hypogaea L) []國生化藥物雜志,1998, 19(3):161-163.Pakistan Jourmal of botany , 1995 ,27(2):405- -409.中國煤化工MYHCNMH G