中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志2008年2月第1卷第2期文章編號(hào)1007-9564(2008)02-0271-04蛋白類藥物聚乙二醇修飾的研究400038重慶市,重慶大學(xué)生物工程學(xué)院曠瑜王金霞王伯初程永剛°肖中元”徐波關(guān)鍵詞蛋白類藥物;豪乙二醇;化學(xué)修悼物循環(huán)半衰期的延長(zhǎng)。同時(shí),PEG修飾會(huì)使蛋白活性降低,這種影響大小與修飾劑修飾條件和蛋白本隨著蛋白質(zhì)化學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展,用于各身的特點(diǎn)相關(guān)種疾病治療的蛋白質(zhì)類藥物的研制和應(yīng)用已成為生mPEG的末端羥基是其反應(yīng)基團(tuán),若直接和蛋物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的熱點(diǎn)。蛋白藥物具有作用專白反應(yīng),反應(yīng)條件較為苛刻會(huì)導(dǎo)致蛋白生物活性降高效等優(yōu)點(diǎn)。估計(jì)現(xiàn)在蛋白藥物(糖蛋白非糖蛋白低或喪失。為使蛋白能在溫和條件下以較高的速率和抗體)的年增長(zhǎng)率為10%~35%,然而蛋白作為藥物注射入生物體內(nèi)時(shí),具有自身的缺點(diǎn):免疫和PEG偶聯(lián)需先將PEG活化,如烷基化或?；?、半衰期短酶解性以及低的溶解度。這些缺點(diǎn)等。使之轉(zhuǎn)化成活潑酯醛基酰肼等嚴(yán)重制約了蛋白類藥物的發(fā)展。解決這類問(wèn)題的方3mPEG修飾蛋白的種類法主要有2:①對(duì)氨基酸序列的處理以降低免疫原31mPEG對(duì)氨基的修飾選擇氨基作為修飾位性和酶解性;②連接于免疫球蛋白或漿蛋白如清蛋點(diǎn),因?yàn)榘被哂杏H核性且大多存在于蛋白的表白( Albumin);③與藥物載體相結(jié)合,以起到對(duì)藥物面,最普遍的是賴氨酸的e-氨基和N末端氨基的保護(hù)和緩釋作用;④連接天然或合成的聚合物。常用的mPEG活性酯有:①PEG二氯三嗪衍生物目前對(duì)蛋白藥物進(jìn)行化學(xué)修飾是研究的熱點(diǎn),常用( PeG dichlorotriazine);②PEG三氟乙基磺酸酯修飾劑為聚乙二醇( polyethylene glycol,,PEG)及其( PEG tresylate);③PEG琥珀酰亞胺碳酸酯(P衍生物succinimidyl carbonate);④PEG苯丙三唑碳酸酯1聚乙二醇(PEG)簡(jiǎn)介( PEG benzotriazole carbonate);⑤PEG對(duì)硝基苯碳聚乙二醇(PEG)是由環(huán)氧乙烷聚合而成其分酸酯(PEGp- nitrophenyl carbonate);⑥PEG三氯子式為HO-(CH2CH2O)-CH2CH2-OH,PEG苯碳酸酯( PEG trichlorophenyl carbonate);⑦PEG通常呈電中性,易溶于水和許多有機(jī)溶劑如乙醇、二碳酰咪唑酯( PEG carbonylimidazole);⑧PEG琥珀甲苯丙酮等。PEG的分子量從幾百到幾萬(wàn),選擇酰亞胺琥珀酸酯( PEG succinimidyl succinate),性大用于醫(yī)藥的PEG分子量主要介于幾百到它們與蛋白的反應(yīng)如圖120000之間。分子量超過(guò)1000的PEG通常無(wú)毒,但此類反應(yīng)具有一定缺陷:①二醇分子的存在是FDA批準(zhǔn)的可用于藥物、食品和化妝品的粟合②僅局限于低分子量的mPEG1③連接鍵不穩(wěn)定;④物。直接用PEG修飾時(shí)易發(fā)生交聯(lián)和團(tuán)聚現(xiàn)象,故副反應(yīng)較多;⑤選擇性差等。所以修飾結(jié)果并不理單甲氧基棗乙二醇( monomethoxy PEG,mPEG)應(yīng)想。于是有人采用PEG醛來(lái)對(duì)蛋白進(jìn)行修飾,例用較多,其分子式為CH3O-(CH2CH2O)CH2CH2-OH,即將PEG一端的活性羥基用甲基如 Kinslter等在對(duì)G-CSF、sTNF-RI等進(jìn)行PEG化時(shí),發(fā)現(xiàn)PEG-丙醛在酸性條件下(pH=5)封閉,以減少或避免交聯(lián)或團(tuán)聚現(xiàn)象2PEG修飾蛋白的原理與a-氨基的偶合具有高的選擇性,這是由于a-氨PEG與蛋白的非必需基團(tuán)結(jié)合后可作為一種基和其他親核類基團(tuán)相比具有較低的pKa值。親屏障擋住蛋白分子表面的抗原決定簇避免抗體的電類PEG衍生物與氨基酸殘基反應(yīng)時(shí),很大程度上產(chǎn)生或者阻止抗原和抗體的結(jié)合而抑制免疫反應(yīng)的取決于氨基酸殘基的親核性親核反應(yīng)只有在蛋白產(chǎn)生。蛋白經(jīng)PEG修飾后,分子量增加腎小球過(guò)水中國(guó)煤作平基的pa值時(shí)才濾減少,PEG的屏障作用保護(hù)了蛋白不易被蛋白酶會(huì)發(fā)物以及PEG羧酸降解同時(shí)減少了抗體的產(chǎn)生,這些均有助于蛋白藥酯也CNMHG專一性,太極集團(tuán)西南藥業(yè)殷份有限公司272Chinese Journal of Coal Industry Medicine Feb 2008, vol 11. No. 23.2PEG對(duì)巰基的修飾蛋白中的巰基主要為半( hydrazone)或與PEG-胺(PEG- amine)反應(yīng)生胱氨酸殘基所攜帶,由于蛋白表面半胱氨酸殘基數(shù)成可逆的Schf堿( Schiff base)1.用硼氫甲腈鈉比賴氨酸殘基數(shù)少得多,所以蛋白中半胱氨酸殘基可將腙還原為更穩(wěn)定的烷基肼化物,而Scff堿可被是一個(gè)很好的靶位,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的特異性修飾。還原為仲胺。用PEG氨基進(jìn)行還原性烷基化存在常用的PEG修飾劑及反應(yīng)如圖2。的主要問(wèn)題是,蛋白質(zhì)上的氨基與PEG氨基具有相似的反應(yīng)活性,就有可能形成交聯(lián)聚集體。此情況下PEG肼化物就更為實(shí)用PEG對(duì)蛋白羧基的修飾羧基的修飾位點(diǎn)包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。通常在二環(huán)已基碳二亞胺(DCCI或1-乙基-3-二甲氨基丙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)存在下,羧基可與氨基PEG結(jié)合,但同時(shí)也易產(chǎn)生其他的交聯(lián)反應(yīng)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)PEG-酰肼(PEG- hydrazide)可與羧基特異結(jié)合。在EDC存在下,酸性條件(pH4.5~5.0)時(shí),蛋白質(zhì)中氨基被質(zhì)子化而無(wú)交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。反應(yīng)如圖3圖1與氨基反應(yīng)的PEG衍生物圖3PEG-酰肼對(duì)羧基的修飾3.5PEG對(duì)蛋白的可逆修飾大多數(shù)PEG化化學(xué)的設(shè)計(jì)是使PEG與蛋白質(zhì)之間形成穩(wěn)定的連接SH-R鍵10,以利于偶聯(lián)物的純化和長(zhǎng)期保存。但有時(shí)PEG會(huì)占據(jù)或屏蔽蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)而降低其活性。另外,PEG偶聯(lián)物分子量對(duì)于蛋白的活性有直接影響,分子量越大則體外活性越低而體內(nèi)活性越高。最優(yōu)蛋白PEG修飾目標(biāo)是既要延長(zhǎng)藥物的半衰期,又不降低藥物的活性。3)mPEG-NHCCHI+SHH-R一種方法是在蛋白和PEG之間采用可降解的CAS-R化學(xué)鍵連接,然后在另外的條件或酶的作用下使+SH-R蛋白從連接物上釋放出來(lái),從而恢復(fù)蛋白活性。例如(見(jiàn)圖4)圖2和巰基反應(yīng)的PEG衍生物及其反應(yīng)若蛋白中已有的巰基不理想,可采用基因工程手段將半胱氨酸引人到蛋白的特定位點(diǎn),就可以采用對(duì)巰基有特異性反應(yīng)的PEG衍生物對(duì)巰基進(jìn)行高選擇性修飾。但通過(guò)這種途徑引入半胱氨酸,會(huì)增加不正確二硫化物和蛋白二聚的幾率山COCH,LCHC-OC3.3PEG對(duì)糖類殘基的修飾對(duì)糖類殘基的修飾中國(guó)煤化工也是一種定點(diǎn)PEG化的方法,糖類經(jīng)過(guò)酶或化CNMHGO學(xué)氧化劑氧化,產(chǎn)生具有反應(yīng)活性的醛基這些醛基現(xiàn)L人CNH可以和PEG-肼(PEG- hydrazide)反應(yīng)生成腙圖4蛋白和PEG雙酯的結(jié)合與釋放過(guò)程中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志2008年2月第11卷第2期·273·影響PEG修飾反應(yīng)的因素聯(lián)分子數(shù)增加后,修飾不均一性也會(huì)增加蛋白經(jīng)過(guò)PEG修飾后,性質(zhì)會(huì)有多方面的改47藥物濃度藥物濃度的增加增大了藥物分子變6-11:①免疫原性和抗原性的降低;②循環(huán)半衰和聚乙二醇分子碰撞的機(jī)會(huì)能提高反應(yīng)速率;但濃期的延長(zhǎng);③溶解性增加;④耐蛋白酶水解;⑤生物度增大的同時(shí)也增加了藥物形成多聚體的機(jī)會(huì),產(chǎn)利用度提高;⑥毒性減小;⑦熱穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性物的均一性會(huì)減小。所以必須兼顧二者的平衡增加;⑧等電點(diǎn)、電泳行為以及動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的改變。4.8反應(yīng)時(shí)間隨著時(shí)間的增加,產(chǎn)物的修飾率會(huì)同時(shí),蛋白經(jīng)修飾后,其生物活性會(huì)降低。影響因素增加,但產(chǎn)物的不均一性也會(huì)增加有多種,主要取決于PEG化程度、PEG化位點(diǎn)及修以上因素對(duì)PEG修飾的影響對(duì)于不同的蛋白飾蛋白構(gòu)象和電荷的影響等。所以有必要建立有所不同要根據(jù)蛋白本身特點(diǎn),同時(shí)考慮修飾后的PEG修飾最優(yōu)方案,以實(shí)現(xiàn)蛋白藥物生物活性的保目的修飾的程度、修飾位點(diǎn)的選擇、產(chǎn)業(yè)化難易程留、一般性能的改善產(chǎn)品毒性減少,反應(yīng)后產(chǎn)品的度及生產(chǎn)成本等因素,通過(guò)單因子及正交實(shí)驗(yàn)確定高回收率等。最優(yōu)方案篩選應(yīng)考慮如下因素:最優(yōu)反應(yīng)工藝。4.1修飾劑的選擇修飾劑的選擇應(yīng)綜合考慮修5結(jié)語(yǔ)飾劑的水解穩(wěn)定性及反應(yīng)活性、修飾劑與蛋白質(zhì)氨M.J. Roberts等10提出PEG修飾的分代學(xué),基酸殘基之間反應(yīng)專一性、修飾位點(diǎn)、修飾劑與蛋白第一代PEG技術(shù)主要限定于小分子量PEG,因?yàn)橘|(zhì)連接鍵的穩(wěn)定性毒性、抗原性、修飾后是否需要在高分子量mPEG中含有大量二醇(聚合過(guò)程中水進(jìn)一步分離是否適于建立快速方便的分析方法修的存在所引起)。高二醇含量會(huì)引起很多的問(wèn)題如飾劑是否能夠簡(jiǎn)便快速地合成或購(gòu)買等因素2交聯(lián)現(xiàn)象。另外,第一代PEG技術(shù)中低分子量4.2修飾反應(yīng)的pH值pH值是PEG修飾蛋白PEG修飾沒(méi)有選擇性,也是由于小分子量PEG有的一個(gè)重要的因素因?yàn)樗鼪Q定了具有潛在反應(yīng)能更多的機(jī)會(huì)刺穿蛋白分子的表面,從而引起較多位力的功能基所處的可反應(yīng)和不可反應(yīng)的離子狀態(tài),點(diǎn)的結(jié)合。而第二代的PEG化技術(shù)避免了第一代般情況下,增加pH可以提高反應(yīng)速率,降低pH技術(shù)的缺點(diǎn),多采用高分子量PEG活性酯,同時(shí)改值會(huì)減小反應(yīng)速率。同時(shí)控制合適的pH值可以對(duì)進(jìn)了生產(chǎn)工藝,降低了PEG中二醇的含量,其應(yīng)用蛋白中氨基酸殘基進(jìn)行特異性修飾,使修飾專一性越來(lái)越廣泛,1提高,從而提高收得率降低分離難度,減少生產(chǎn)成經(jīng)過(guò)PEG修飾的藥物蛋白不僅較高地維持了原藥的生物活性,而且能夠有效地降低或消除其免4.3藥物與PEG的摩爾比通常情況下,隨著疫原性和毒性。同時(shí),由于分子量和交聯(lián)度的增加PEG和蛋白的摩爾比增加,修飾蛋白的相對(duì)分子質(zhì)修飾后的藥物蛋白的循環(huán)半衰期顯著延長(zhǎng)。從而顯量也會(huì)增加蛋白的修飾率會(huì)提高,但修飾的不均一示了藥物蛋白PEG修飾技術(shù)的良好應(yīng)用前景。度也會(huì)增加生物活性保留會(huì)下降故必須控制合適6參考文獻(xiàn)的比例,使蛋白修飾率最高,同時(shí)也盡可能保留蛋白[1]姜忠義許松偉,王艷強(qiáng)蛋白質(zhì)和肽類分子的聚乙的生物活性。二醇化化學(xué)[J].有機(jī)化學(xué),2003,23(12):13404.4反應(yīng)溫度蛋白藥物對(duì)溫度的穩(wěn)定性較差,要1347使蛋白藥物修飾后仍然保留高的生物活性,反應(yīng)必[2] K. Rajender Reddy MD, Marlence W Modi PhD,Si-須在蛋白的耐受溫度下進(jìn)行。而同時(shí)溫度也決定反mon Pedder PhD. Use of peginterferon alfa-2a(40應(yīng)速率,影響修飾的均一性。對(duì)于巰基的修飾來(lái)說(shuō),KD)(Pegasys) for the treatment of hepatitis C[J]溫度可以影響到活性巰基的微環(huán)境,仔細(xì)選擇溫度Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54: 571可以降低活性,防止一些競(jìng)爭(zhēng)基團(tuán)的反應(yīng)。[3] Yu-Sen Wang, Stephen Youngster, Micheal Grace4.5PEG分子量增加PEG的分子量可以延長(zhǎng)et al. Structural and biological characterization of pe-藥物的半衰期。而且支鏈的PEG比直鏈的更具有優(yōu)勢(shì),因?yàn)橹ф湹腜EG可以減緩在腎小球中的濾中國(guó)煤化工lanced Drug DeliveryCNMHG4.6偶聯(lián)的PEG分子數(shù)增加偶聯(lián)的分子數(shù)等于FM, Morpurgo M. Bioconjugation in phar增加PEG的分子量,因而也會(huì)延長(zhǎng)半衰期。但是偶maceutical chemistry[J]. Inter J Pharmaco, 1999. 54·274Chinese Journal of Coal Industry Medicine Feb 2008, Vol 11, No. 2and Biological application[A]. Acs symposi[5] Zalipsky S Chemistry of poly (ethylene glycoL)con-Series No680[C]. Washington, DC, Amerricanjugates with biologically active molecules [J]. 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Poly(ethylene glycol)Chem-文章編號(hào)1007-9564(2008)02-0274-02完全腹腔鏡下右肝癌切除2例363000福建省漳州市,福建醫(yī)科大學(xué)附屬津州市醫(yī)院普外一科李建國(guó)韓明瑞陳德烽李輝林志川關(guān)鍵調(diào)肝癌;腹腔鏡;外科手術(shù)塊,AFP>1000ng/L,乙肝小三陽(yáng),肝功能ChdA級(jí)。胃鏡提示:十二指腸球部潰瘍(S1期)1資料與方法1.2手術(shù)器械腹腔鏡(美國(guó)史賽克)超聲止血刀11病例資料例1,男,57歲,主訴右上腹悶痛(美國(guó)強(qiáng)生公司制造)腹腔鏡彭氏多功能刮吸器2個(gè)月于2006年3月15日人院。彩超提示:右肝1.3手術(shù)方法全麻下,腹腔壓力14mmHg臍下前葉4.3cm×3.9cm×3.7cm腫塊;MR:左肝內(nèi)葉建立觀察孔,置人10mm30度鏡,劍突下建立主操4.3cm×4.4cm×4.5cm,AFP>1000ng/L,乙肝作孔,右助下及右腋前線平臍建立輔助孔。無(wú)肝門小三陽(yáng),肝功能 Child A級(jí)。胃鏡提示:慢性淺表性阻斷采用超聲刀及彭氏多功能刮吸器交替使用切胃炎。肝法,中國(guó)煤化工面止血后用生例2男,54歲,主訴右上腹疼痛于2006年6月物蛋CNMH右肋下操作孔29日入院。彩超提示:右肝3.0cm×3.2cm×3.0擴(kuò)大后取出,常規(guī)量雙套管沖洗引流。cm腫塊CT:左肝內(nèi)葉3.0cmx2.6cm×3.0cm腫2結(jié)果