中國醫(yī)藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 22007,38(6)423藥物制劑雙氨基聚乙二醇的制備及分離純化劉敏,徐雯,朱葉歡,潘弘,陸偉躍*(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室,上海200032摘要:聚乙二醇2000經(jīng)氯代、疊氮化、氫化還原3步反應(yīng)制得雙氨基聚乙二醇(1)粗品,總收率57%采用陽離子交換樹脂,以不同濃度的乙酸鹽緩沖液(pH5.7)梯度洗脫,得到的1純品采用IR、HNMR和HPLC等方法進(jìn)行檢測,并用高效分子排阻色譜法測定相對分子量。關(guān)鍵詞:雙氨基聚乙二醇;制備;純化;檢測中圖分類號(hào):TQ314.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1001-8255(0006-0423-04 Preparation and Purification of Amino-terminated Poly(ethylene glycol) LIU Min, XU Wen, ZHU Ye-huan, PAN Hong, LU Wei-yue* iversity, S ABSTRACT: The amino-terminated poly(ethylene glycol)(1) was obtained from polyethylene glycol 2000 by chlorination, azidation and catalytic hydrogenation with an overall yield of 57%. The title compound was purified using cation exchange resin with gradient eluent of acetate buffer solution (pH 5.7) of different concentrations. The structure of pure product was characterized by IR,'HNMR HPLC. The relative molecular weight of was determined by size- exclusion chromatography. Key Words: amino-terminated poly (ethylene glycol) preparation; purification; characterization聚乙二醇(PEG)是由乙醇單體聚合而成的線形 Staudinger法由于疊氮化物還原法具有成本高分子,結(jié)構(gòu)式為(OCHCH2OH目前廣泛用低、反應(yīng)條件溫和、胺化產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn),本研究來修飾多肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、納米粒等藥物和載采用該法以PEG2000為原料,經(jīng)氯代、疊氮化、體16PEG的末端羥基須在較激烈的條件才能與氫化還原3步制備了雙氨基PEG(1),總收率57%。其它基團(tuán)發(fā)生反應(yīng),因此必須通過適當(dāng)方式活化。再利用陽離子交換樹脂分離純化,最后通過IR、可根據(jù)不同需要,用醛基、氨基、異氰酸酯基、羧HNMR和HPLC進(jìn)行檢測,并測定相對分子量。基和烯基等基團(tuán)取代該羥基78傳統(tǒng)活化方法包1儀器與試藥括氰脲酰氯法和羥基琥珀酰亞胺法。其中胺化方法 Akta explorer型中壓層析系統(tǒng)(瑞典安發(fā)瑪西亞包括甲苯磺酸酯法、疊氮化物還原法及 Mitsunobu--公司):1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司) AVATARTM360型傅里葉變換紅 Thermo外光譜儀(美國收稿日期:2006-07-31基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基(30672545)和上海市納米科技專項(xiàng)基 Nicolet公司) Mercury Plus4 400hz型超導(dǎo)核磁共振波譜儀金(0652nm011)(美國Varian公司)。作者簡介:劉敏(1969),女,碩士,講師,從事高分子藥物載體和脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)研究。PEG2000(化學(xué)純,中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑 E-mail: liumin@shmu.edu.公司);PEG對照品(相對分子質(zhì)量1000、2000、3350、通訊聯(lián)系人:陸偉躍(1960),男,教授,博士生導(dǎo)師,從事藥物靶向傳釋系統(tǒng)研究600、10000和20000,美國 Sigma公司):單氨基聚乙二醇tel:021-54237040:fax:021-641787902000和1對照 Shearwater品(美國 Polymer公司) E-mail: wylu@shmu.edu.cn424中國醫(yī)藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals2007,38(6)2方法與結(jié)果88%)。2.11的制備2.21的分離純化2.1.1試劑的預(yù)處理先前的研究中,本試驗(yàn)室已建立了檢測1純度氯化亞砜:氯化亞砜200ml中加喹啉60ml,混的PLC法.利用Tsk-gelg4000PW凝膠滲勻,放置過夜。過濾,濾液蒸餾,收集約72℃的餾透色譜柱上存在的少量荷負(fù)電的基團(tuán)與酸性條件分。所得餾分重蒸餾,收集76~78℃的餾分,避光下荷正電PEG的氨基之間的離子交換作用,用低密閉保存。離子強(qiáng)度的流動(dòng)相洗脫,無氨基取代的PEG2000乙醇:取鎂條2.5g和碘0.5g置無水乙醇50ml首先被洗脫,單氨基聚乙二醇次之,1再次之。中,80℃回流30min。補(bǔ)加無水乙醇600ml,回流色譜條件如下:色譜柱Tsk-gelg4000PWxL柱30min后蒸餾,收集78℃的餾分,避光密閉保存(7.8mm×300mm,10um),示差折光檢測器,流動(dòng)甲苯、二氯甲烷、DMF和吡啶等試劑均經(jīng)無相5mmol/氯化鈉溶液(pH4.0),流速0.5ml/min,水處理。柱溫25℃,進(jìn)樣量20u1。色譜圖見圖1。購得的2.1.2雙氯代聚乙二醇(2)PEG2000、單氨基聚乙二醇和1保留時(shí)間分別為取PEG200080g(0.04mol)溶于甲苯350ml中21.2、23.6和30.6min,測得自制的1粗品主峰保留再加入吡啶8ml和氯化亞砜23ml,120℃回流2h。時(shí)間基本與購得品相同。照峰面積積分法計(jì)算,粗反應(yīng)液冷至室溫,過濾,濾液減壓蒸除甲苯,冷至品中1的含量為78%。室溫。所得黏稠液體中加入二氯甲烷300ml和A2O3200g(2mol),攪拌2h,過濾濾液減壓蒸去二氯12000甲烷。剩余物滴至冷無水乙醚2.5L中,析出白色8000沉淀,抽濾,濾餅減壓干燥,得白色粉末狀固體24000(60g,以PEG2000計(jì),收率為75%)。R0.59[展開0劑:氯仿二氯甲烷-甲醇-正丁醇(5:3:3:0.1),6000B10203040碘蒸氣顯色]4000↓2.1.3雙疊氮聚乙二醇(3)如上所得2(60g,0.029mol)溶于DMF400ml2000中,加入疊氮化鈉35g(0.54mol),115℃回流2h,003040冷至室溫,過濾。濾液減壓蒸除DMF,冷至室溫,用二氯甲烷300ml溶解,過濾,濾液濃縮后滴0A t/minA:購得品,B:自制粗品至冷無水乙醚3L中沉淀,抽濾,濾餅減壓干燥,得1-1:2-單氨基聚乙二醇2000:3-PEG2000圖1HPLC圖譜白色固體3(52g,以2計(jì),收率87%)。R0.71[展開劑:氯仿甲醇丙酮正丁醇(8.2:1:1:1.6),碘采用 UNOsphere TM強(qiáng)陽離子交換柱(美國蒸氣顯色]。Bio-rad,25mm×120mm,100um),用10mmol/L2.1.4雙氨基聚乙二醇(1)乙酸鹽緩沖液(pH5.7)平衡色譜柱。取1粗品3g,將如上所得3(52g,0.025mol)溶于無水乙醇二以注射用水10ml溶解,上柱。梯度洗脫[洗脫液氯甲烷(6:1)混合溶劑300ml中,加10%炭g,A:10mmol/L乙酸鹽緩沖液(pH5.7),洗脫液B:室溫5atm氫化24h.反應(yīng)液經(jīng)0.22μm微孔濾膜抽60mmol/L乙酸鹽緩沖液(pH5.7),100min內(nèi)洗脫濾,濾液濃縮后滴至冷無水乙醚3L中沉淀,抽濾,液從100%A轉(zhuǎn)為100%B],流速3ml/min。用上述濾餅減壓干燥,得白色1粗品(46g,以3計(jì),收率HPLC法檢測洗脫液。合并含單氨基聚乙二醇組分中國醫(yī)藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 22007,38(6)425的洗脫液,用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH9.0,凍干。取1600凍干品2g上 Sephadex G--15柱,以注射用水為洗脫1200液脫鹽,收集洗脫液凍干,得1純品[1.5g,精制率80050%,純度>95%(HPLC法)],色譜圖見圖2402.3結(jié)構(gòu)表征與相對分子量測定0102030402.3.1紅外光譜和HNMR t/min紅外光譜:KBr壓片,結(jié)果見圖3。與PEG1-12000的紅外光譜比較,1純品圖譜中3400cm附近圖21純品的色譜圖出現(xiàn)一個(gè)弱的寬吸收帶,其強(qiáng)度遠(yuǎn)低于U(中等強(qiáng)度),可能為特征峰;兩者均在2887cm出現(xiàn)一等強(qiáng)度:1114cm處出現(xiàn)強(qiáng)的尖吸收帶為特征個(gè)很強(qiáng)的尖吸收帶,即亞甲基的特征峰;另外峰。亞甲基對應(yīng)的剪式振動(dòng)吸收帶位于1467cm處,中10.0A8.0948601t4.02.040003500300025002000150010050400035003000250020001001000500圖3PEG2000(A)和1(B)的紅外圖譜HNMR:溶劑為重水,樣品濃度為10mg/ml,ch2-Ch2-O-(PEG分子中):83.3~3.8(多重結(jié)果見圖41純品,一NH2:82.9(2H,三重峰),峰)。876543217654321圖4PG2000(A)1(B)的HNMR圖譜2.3.2高效分子排阻色譜法測定1相對分子量分子量。色譜條件如下:色譜柱 TSK GEL G22000照中國藥典2005年版附錄VH和右旋糖酐20wL,示差折光檢測器,流動(dòng)相0.7%硫酸鈉溶液(P88)的分子量與分子量分布項(xiàng)下方法測定1相對(含0.02%疊氮化鈉),柱溫35℃,流速0.5ml/min,426·中國醫(yī)藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2200,38(6)進(jìn)樣量20u1。1純品加流動(dòng)相制成濃度為10mg/ml的各種特征峰都存在,包括CH的伸縮振動(dòng)峰、的溶液,作為供試品溶液。另取5個(gè)已知分子量的-CH2-的剪式振動(dòng)峰和C-0C的伸縮振動(dòng)峰PEG對照品,同法制成10mg/ml的溶液作為對照品等HNMR圖譜中,與PEG2000圖譜比較,在溶液。分別進(jìn)樣測定,采用GPC軟件(美國 Agilent82.90處增加了一個(gè)三重峰,推斷是與-CH2連接的公司,A.02.01版本)將保留時(shí)間對對照品分子量線NH2的化學(xué)位移,且含與重復(fù)結(jié)構(gòu)一CH2CH2O相性回歸,由所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品的相對分子同的化學(xué)位移。HPLC檢測結(jié)果顯示自制1具有與購量。結(jié)果表明,1的重均分子量為2045,分子量分得品相同的保留時(shí)間,結(jié)合分子量等數(shù)據(jù),可確證散程度為1.0915。結(jié)構(gòu)。3討論3.11的制備參考文獻(xiàn)本實(shí)驗(yàn)制備1的總收率為57%,粗品純度為1]蔣為民王妍蛋白質(zhì)藥物的聚乙二醇修飾微生物學(xué)78%。在制備過程中應(yīng)該注意以下幾點(diǎn):首先,氯免疫學(xué)進(jìn)展,2005,33(4):72-75.2]趙蓉,朱家壁聚乙二醇修飾的立體穩(wěn)定脂質(zhì)體]國外代反應(yīng)時(shí)加入氯化亞砜后會(huì)產(chǎn)生大量沉淀,這些沉醫(yī)學(xué):藥學(xué)分冊,1999,26(3):161-166淀經(jīng)TLC檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)同樣含有2,因此,用二氯甲[3]麗紅梅興國章?lián)P培.新一代PEG在修飾抗原和藥物緩?fù)楸M可能地將沉淀中的2溶解出來與產(chǎn)品合并一起釋中的應(yīng)用[]生命科學(xué),2004,16(5):296-300進(jìn)行處理以提高產(chǎn)率;其次,由于生成的2中可能[4]趙樹進(jìn),尹亮,郭勇,等聚乙二醇修飾后超氧化物岐化含有雜質(zhì)硫,而硫的存在將導(dǎo)致后續(xù)氫化還原步驟酶的穩(wěn)定性及其在家兔體內(nèi)過程[中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,中的鈀炭催化劑中毒,因此在產(chǎn)品中加入活化的氧2003,23(4):193-196化鋁以吸附硫及其它雜質(zhì)。最后,3步反應(yīng)都是采【5]張字鋒謝蜀生,侯新樸,等具有活性羧基末端的長循環(huán)脂質(zhì)體的制備和分布[]藥學(xué)學(xué)報(bào),2000,35(11):用無水乙醚沉淀法得到產(chǎn)品,無水乙醚的用量應(yīng)至854-859.少為濃縮液的8~10倍,且冷的無水乙醚沉淀效果[6]付春曉蛋白的聚乙二醇修飾及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用更好。]國外醫(yī)學(xué):藥學(xué)分冊,2001,28(2):78-81.3.21的分離純化[7]董炎明高分子材料實(shí)用剖析技術(shù)[M].北京:中國石化出1粗品中的主要雜質(zhì)為單氨基聚乙二醇、無氨版社,1997:80-81.基取代的PEG2000和少量小分子物質(zhì)等。陽離子[8]王琴梅潘仕榮,張靜夏雙端氨基聚乙二醇的制備及表征交換樹脂是以陰離子交換劑為固定相,借助于樣品].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2003,34(10):490-492中電離組分對其親和力的不同從而達(dá)到分離離子型 [9] Zalipsky S. Chemistry of polyethylene glycol conjugates with biologically active molecules[]. Ad Drug Deliv Rew.或可離子化的化合物的目的。一般在陽離子交換樹1995,16(2):157-182脂骨架上引入的酸性基團(tuán)有磺酸基、羧基和酚羥 [10] Zalipsky S, Gilon C, Zilkha A. Attachment of drugs to基等。在1純化過程中,首先將1酸化成NH3-PEG polyethylene glycols[J]. Eur Polym J, 1983, 19(12):2000-NH3,根據(jù)胺基數(shù)目的不同,PEG2000、單1177-1183氨基聚乙二醇、1在陽離子交換樹脂上的吸附性也[11]zalipskys,1《D17ZaIiskyS,ChngJL,AIbcicioctaIPcqanaionam《.preparatonand依次增強(qiáng)。用乙酸鹽緩沖液梯度洗脫可達(dá)到分離純 applications of polyethylene glycol-polystyrene graft resin化的目的。 supports for solid-phase peptide-synthesis[]. React Polym1994,22:243-2583.3結(jié)構(gòu)分析 [12] Liu M, Xie C, Xu W, et al. Separation of polyethyleneIR圖譜中,理論上NH2在3500和3400cm glycols and their amino-substituted derivatives by high-附近有兩條弱的吸收帶,但由于一NH2在1中所占 performance gel filtration chromatography at low ionic比例少,不易顯現(xiàn)。與PEG2000圖譜比較,該處 strength with refractive index detection [J]. J Chromatogr A,吸收帶的強(qiáng)度顯著低于-OH的吸收。另外,PEG04106-2126