釀酒科技2010年第2期(總第188期) LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2010No2(Tol18固定化酵母迕續(xù)發(fā)酵乳清粉生產(chǎn)燃料乙醇的研究郭學(xué)武,周珺,劉森,肖冬光(工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津30022)對混合固定化克魯維酵母和固定化釀酒酵母連續(xù)發(fā)酵乳清生產(chǎn)燃料乙醇進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,對比雙柱式連續(xù)發(fā)酵,混合菌株單柱式連續(xù)發(fā)酵工藝較姸,發(fā)酵周期縮短為36h,酒精度達(dá)到了4.7%vol。關(guān)鍵詞:燃料乙醇;固定化;酵母;乳清粉中圖分類號:Q814;TS2611;TS2622;TS2614文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1001-9286(2010)02-0020-03Research on Continuous fermentation of whey powder by ImmobilizedKluyveromyces marxianus and saccharomyces cerevisiaeto produce fuel ethanolGUO Xue-wu, ZHOU Jun, LIU Miao and XIAO Dong-guang(Key Lab of Industrial Microbiology of Ministry of Education, Tianjin Industrial Microbiology Key Lab,College of Biotechnology of Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300222, China)Abstract: Continuous fermentation of cheese whey powder (CWP)by immobilized Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces cerevisiae toproduce fuel ethanol was studied. The results showed that single-column continuous fermentation by mixed strains was better than double-columncontinuous fermentation(it could shorten fermentation period to 36 h and alcolicity could reach up to 4.7 %vol ).Key words: fuel ethanol; immobilized; yeast; whey powder乳清是乳制品企業(yè)利用牛奶生產(chǎn)干酪時(shí)所得的一種1.12試劑天然副產(chǎn)品,其主要成分有乳糖乳清蛋白、礦物質(zhì)等,具乳清粉:地球牌甜乳清粉,天津奧凱化工貿(mào)易有限公有很高的營養(yǎng)價(jià)值。近年來,關(guān)于如何利用乳清的問題一司;海藻酸鈉:上?；瘜W(xué)試劑廠;氯化鈣:天津市凱通化學(xué)直是研究的重點(diǎn)。目前已經(jīng)有一些關(guān)于利用乳清生產(chǎn)乙試劑有限公司。醇、單細(xì)胞蛋白、沼氣等的研究報(bào)道1.2種子培養(yǎng)基但是,利用乳清生產(chǎn)乙醇存在乙醇得率低(2%volYEPD;發(fā)酵培養(yǎng)基:乳清粉水溶液:乳清粉12%3%vl)、分離成本高等問題。乳清粉是乳清濃縮干燥(wv),pH6.0,于110℃,20min滅菌。初始糖濃度為的產(chǎn)物,其相比乳清來說具有營養(yǎng)物質(zhì)濃度高、可長期100g穩(wěn)定放置等優(yōu)點(diǎn),是一種較好的替代乳清生產(chǎn)乙醇的1.3酵母細(xì)胞的固定化方法原料S。筆者已經(jīng)報(bào)道過關(guān)于固定化酵母發(fā)酵乳清的研參考文獻(xiàn)[6],并根據(jù)各試驗(yàn)需要,選擇各自所需細(xì)究,本文進(jìn)一步對固定化酵母連續(xù)發(fā)酵乳清粉生產(chǎn)乙胞濃度。醇進(jìn)行研究,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。4酵母細(xì)胞的增殖培養(yǎng)1材料與方法將制備好的固定化酵母凝膠顆粒接入到Y(jié)EPD中30℃活化24h。1.1材料1.5實(shí)驗(yàn)方法1.L.1菌種固定化細(xì)胞發(fā)酵:將獲得的固定化酵母菌液體種子馬克思克魯維酵母( Kluyveromyces marxianus)TY-接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、120rmin,進(jìn)行固定化細(xì)胞發(fā)13釀酒酵母( accharomyces cerevisiae)AY-5均為本室酵,并根據(jù)各試驗(yàn)需要,選擇各自所需固定化細(xì)胞的濃保存。度中國煤化工基金項(xiàng)目:天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(09 JCZDJC17900),天03),2009-2010學(xué)年天津科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目資助。CNMHG收稿日期:2009-12-15作者簡介:郭學(xué)武(1980-),男湖南人,助理研究員,研究方向:現(xiàn)代釀造技術(shù)通訊作者:肖冬光(1956),教授、博士生導(dǎo)師xdg@tust.edu.cn郭學(xué)武,周珺,劉森,肖冬光·固定化酵母連續(xù)發(fā)酵乳清粉生產(chǎn)燃料乙醇的研究單柱連續(xù)發(fā)酵:見圖1。首先將發(fā)酵液填滿發(fā)酵柱,通過改變恒流泵的轉(zhuǎn)速改變向柱式反應(yīng)器內(nèi)加入并按10%接種量接人增殖好的固定化酵母顆粒,并且通發(fā)酵液的流量,最終改變發(fā)酵稀釋速率,進(jìn)行固定化酵過恒流泵使柱體內(nèi)的發(fā)酵液按22mI/min的速度進(jìn)行循母細(xì)胞發(fā)酵實(shí)驗(yàn),確定最佳稀釋率。首先,先將發(fā)酵液填環(huán),以提高發(fā)酵速度。發(fā)酵一定時(shí)間后,當(dāng)殘?zhí)呛拷档蜐M柱式反應(yīng)器,并接入酵母凝膠顆粒,先反應(yīng)一定時(shí)間,至2g10mL后,開始以15mLh的流量(即稀釋率為當(dāng)流出的反應(yīng)液的殘?zhí)呛坑沙跏嫉膌0g/100mL降低0025h)向柱式反應(yīng)器注入新鮮發(fā)酵液,通過固定化酵至2g100mL時(shí),開始將發(fā)酵液以不同的流量流人柱式母細(xì)胞層進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。并且每隔4~12h不等的時(shí)間反應(yīng)器,待反應(yīng)穩(wěn)定后測定其酒精度及殘?zhí)侵?。恒流泵轉(zhuǎn)段對流出的發(fā)酵醪液中的殘?zhí)呛俊⒕凭?、PH值和細(xì)速與稀釋率換算見表1,不同稀釋率對殘?zhí)呛亢途凭孤?shù)進(jìn)行測定。度的影響見圖3。表1轉(zhuǎn)速與稀釋率對照結(jié)果恒流泵轉(zhuǎn)速進(jìn)料速度稀釋率平均停留時(shí)間(r/min)(h)0150.8150.02540b0. 5r/min-lr/min-0. 8r/min1.5r/min注:1發(fā)酵液,2.恒流泵,3反應(yīng)柱,4進(jìn)料口,5循環(huán)液進(jìn)料口,6.出料口,7循環(huán)液出料口圖1單柱式連續(xù)發(fā)酵示意圖雙柱串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵:如圖2所示,首先將發(fā)酵液填滿A發(fā)酵柱,并按10%接種量接入TY-13酵母顆粒,并且通過恒流泵使柱體內(nèi)的發(fā)酵液進(jìn)行循環(huán),發(fā)酵3h后,也681224由恒流泵作用使A發(fā)酵柱內(nèi)的發(fā)酵液流入已按10%接時(shí)間(h)種量裝填好AY-5酵母顆粒的B發(fā)酵柱。當(dāng)流出液的殘a不同稀釋率對殘?zhí)呛康挠绊懱呛拷档椭?g/100mL后,開始以15mLh的流量向A柱式反應(yīng)器注人新鮮發(fā)酵液,通過固定化酵母細(xì)胞層2.5進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。并每隔4~12h不等的時(shí)間段對流出的發(fā)酵醪液中的殘?zhí)呛?、酒精度、pH值和細(xì)胞泄漏數(shù)進(jìn)行測定。0.50.8轉(zhuǎn)速(r/min)圖b不同稀釋率對酒精度的影響圖3不同稀釋率對殘?zhí)呛亢途凭鹊挠绊懢W(wǎng)圖3a、圖3b可知,稀釋速率為0025h為佳,此注:L發(fā)醇液2恒流泵,3反應(yīng)柱,4進(jìn)料口,5取樣口,6最終發(fā)酵時(shí)生成的酒精度較高,且發(fā)酵修液中線糖含量較低,反應(yīng)液出料口,7出料口器的生產(chǎn)能力也達(dá)到一定水平。若將稀釋率降低為圖2雙柱式連續(xù)發(fā)酵示意圖0015h,酒精度與殘?zhí)呛烤认♂屄蕿?.025h時(shí)較優(yōu),但優(yōu)勢并不明顯,且平均停留時(shí)間明顯延長,故最終1.6檢測方法選擇稀釋率為0.025h為宜?？偺堑臏y定采用菲林滴定法,乙醇釆用快速氧化22中國煤化工法測定。確定2結(jié)果與分析CNMHG,由于發(fā)酵液體積僅為600mL,且固定化顆粒密度較髙,易于沉入發(fā)酵液的下21連續(xù)發(fā)酵稀釋率的確定層,使得發(fā)酵液與固定化細(xì)胞接觸面積較小,因此,為防釀酒科技2010年第2期(總第188期)· LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2010No2Toll8表2不同循環(huán)速度對殘?zhí)呛亢途凭鹊挠绊憣^低,酒精度也達(dá)到相應(yīng)水平。轉(zhuǎn)速發(fā)酵時(shí)間(h酒精含量2.3固定化雙柱串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵(r/min)4812243648607296120(%vo)207.86.44.63.22.2般釀酒酵母不能直接利用乳糖需要由克魯維酵母首先將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖后才能60684.82.90.90.690.480.40.42.441.447利用。由于混菌固定化酵母單柱式發(fā)酵,雖然能提806.64.72.70.850.650.460.410.40.40.44.8供發(fā)酵液的循環(huán)流動,但還不能保證兩種酵母的接1006.54.82.60.820.660.470.40.390.380.394.8種時(shí)間間隔,因此,還需要再對連續(xù)發(fā)酵的模式進(jìn)行探討,以確定最佳的連續(xù)發(fā)酵的模式。參照15止發(fā)酵液發(fā)酵不完全,故通過恒流泵的蠕動使發(fā)酵液可的實(shí)驗(yàn)方法,對固定化雙柱串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行了研究,實(shí)以循環(huán)流動,以提高發(fā)酵效率。恒流泵分別通過20驗(yàn)結(jié)果見圖4、圖4b。r/min、40rmin、60r/min,80rmin和100rmin5個(gè)不同的轉(zhuǎn)速提供發(fā)酵液的循環(huán)流動。乳清還原液按上述實(shí)驗(yàn)3.5r+殘?zhí)呛俊鸀⒕?內(nèi)容確定以15mLh的速度向柱式反應(yīng)器中流加,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。恒流泵轉(zhuǎn)速與發(fā)酵液循環(huán)速度對照結(jié)果見表3。1.5表3轉(zhuǎn)速與循環(huán)速度對照結(jié)果0.5恒流泵轉(zhuǎn)速(r/in)循環(huán)速度(aL/uin02468243640486072961204015a固定化雙柱串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵對殘?zhí)呛亢途凭鹊挠绊?2[D值變化組胞神高數(shù)1204.820E+6由表3所知,恒流泵轉(zhuǎn)速在60~-100r/min時(shí)對酒精1.5E+06生成量和殘?zhí)侵涤绊懢淮?。因?綜合考慮殘?zhí)呛?、●?.0E+06酒精度以及節(jié)約能源方面的因素,最終確定恒流泵的轉(zhuǎn)5.0E+05合d速以60r/min為最佳。02468243640486072961202.2.2混菌固定化酵母單柱式連續(xù)發(fā)酵時(shí)間(h)通過2.1.1和2.12.1確定的稀釋率和循環(huán)速度,用b固定化雙柱串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵對pH值和細(xì)胞泄漏的影響15的實(shí)驗(yàn)方法,對混菌固定化酵母單柱式連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)圖4分別固定化雙柱串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行了研究,結(jié)果見表4。表4混菌單柱式連續(xù)發(fā)酵結(jié)果由圖4的結(jié)果分析可知,分別固定化雙柱串聯(lián)連續(xù)時(shí)間殘?zhí)呛烤凭燃?xì)胞泄漏數(shù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的平均停留時(shí)間為40h,pH值的變化幅度不大(個(gè)/mL)且從24h開始一直比較穩(wěn)定,說明發(fā)酵進(jìn)人穩(wěn)態(tài)后發(fā)酵0.05.02.1×105液的酸堿性環(huán)境沒有太大變化,且對發(fā)酵效果影響不大。5.345.02.7X105最終發(fā)酵醪液中的殘?zhí)呛繛?.88g/100mL,而酒精生4.761.24.83.5×1051.44.73.9×105成量為40%vol。這種連續(xù)發(fā)酵模式雖然可以保證兩種81,84.64.0×105酵母接種的時(shí)間間隔,但不能提供發(fā)酵液的循環(huán)流動,導(dǎo)3.44.54.5×105致還有部分糖發(fā)酵不完全,使最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯不如0.684.74.36.8×105混菌固定化酵母單柱式連續(xù)發(fā)酵效果好,因此可以說明,4.888×105增加發(fā)酵液的循環(huán)流動對混菌固定化酵母連續(xù)發(fā)酵來說480.484.84.3604.7003.1×10比較重要,既能使發(fā)酵液多次重復(fù)接觸固定化酵母層,還0.4437X10°可以增加一定的氧氣供給,對提高發(fā)酵速度以及發(fā)酵液中的酒精度有一定幫助。由表4中所列出的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)數(shù)值可看出,混菌3單柱式連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)提高了發(fā)酵速度,平均停留時(shí)間為中國煤化工36h。pH值變化幅度不大,且從36h開始一直比較穩(wěn)定,CNMHG002b為最適稀釋說明發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)態(tài)后,發(fā)酵液的酸堿性環(huán)境沒有太大變度。刈比告回正化圈休單杜連續(xù)發(fā)酵和雙柱式連續(xù)化,且對發(fā)酵效果影響不大。發(fā)酵醪液中的殘?zhí)呛恳蚕喟l(fā)酵工藝確定了單柱式連續(xù)發(fā)酵工藝較好其發(fā)酵周期(下轉(zhuǎn)第26頁)釀酒科技2010年第2期(總第188期)· LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2010No.2(Tol18一0.05%-0.20%1.00%響來看,各個(gè)因子影響燃料乙醇濃度的順序分別1+01000人A1=A2>A3、Bl>B2>B3、C2=C3>ClD3>D2>D因此可以確定最佳條件組合為ABCD3、ABCD3A2BCD3、ABCD3,即時(shí)間為12h或24h、溫度32℃pH40或4.5、接種量12%。③從各因子的極差大小RD>RB>RA=RC可知在發(fā)酵條件中,對乙醇濃度影響最大的是酵母用量,其次是溫度,而時(shí)間和pH的影響是最小的。3結(jié)論時(shí)間(h)圖5 Tween-80對水稻秸稈同步糖化發(fā)酵的影響水稻秸稈同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的適宜的發(fā)酵工藝條件為起始pH值為40~45,培養(yǎng)溫度為32℃,優(yōu)化組合試驗(yàn)對發(fā)酵條件中的時(shí)間溫度pH值和接種接種量為12%,發(fā)酵時(shí)間12~24h在此條件下,生成乙量等4個(gè)因素進(jìn)行了正交試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見醇的濃度為14mgmL,水稻秸稈原料的乙醇轉(zhuǎn)化率為表1。7.02%。表1L(3)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析實(shí)驗(yàn)號因素乙醇濃度參考文獻(xiàn):A(時(shí)間,b)B(溫度,℃)C(p)D(接種量%)(mg/毗L)[]徐昶,龍敏南,鄔小兵,等高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條1(12)1(32)1(3.5)1(8)l.1件研究[廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,44(1):10721(12)2(37)2(4.0)2(10)1.3[2] Ghose T K Measurement of cellulase activities). Pure Appl31(12)3(40)3(4.5)3(12)1.3Chem,1987,59(2):257-268.1(32)2(4.0)(24)2(37)3(4.5)1.13]李華,高麗β-葡萄糖苷酶活性測定方法的研究進(jìn)展食品62(24)與生物技術(shù)學(xué)報(bào)2007,26(2):107-11473(36)1(32)3(4.5)2(10)13高培基曲音波,王祖農(nóng)纖維素酶解過程的分析和測定門生2(37)1(3.5)3(36)3(40)2(4.0)1.0[5]沈加成酶解工業(yè)纖維廢渣生成乙醇技術(shù)的研究[D]濟(jì)南:山K12.3330010.東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)K212.33312.33333312.667[6 Helle SS, Duss SJB, Cooper DG. Effect of surfactants on cellulosK312.00033313.333hydrolysis[J]. Biotechnol Bioeng 1993: 42(5): 611-7.0.3331.0000.3332.666[7] Castanon M, Wilke CR Effects of the surfactant Tween-80matic hydrolysis of newspaper[J]. Biotechnol Bioeng, 1981由表1結(jié)果可以看出XxI11365-72①在9個(gè)處理的直觀分析中,第4個(gè)組合條件下燃[8] Kurakake M, Ooshima H, Kato J, Harano Y pretreatment o②從各個(gè)因子不同水平條件對燃料乙醇濃度的影 Kaar We,echn019,49:21-omyr料乙醇濃度最高,為14mgmL。從而可以確定第4個(gè)組合A2BC2D23為最佳條件組合Holtzapple M Benefits from Tween during enzymic中“+-+-+ hydrolysis of com stover[]. Biotechnol Bioeng 1998, 59: 419-27上接第22頁)縮短為36h,酒精度達(dá)到了47%voleters[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38 (5):參考文獻(xiàn):7l1-718.5]Ozmihci, S, Kargi, F, Comparison of yeast strains for batch[1] Siso, M. L Gonza lez. The biotechnological utilization of cheeseethanol fermentation of cheese- whey powder( CWP)solution[J]whey: A review!]. Bioresource Technology, 1996, 57(1): 1-1lLetters in Applied Microbiology, 2007, 44(6): 602-6062]P. Gunasekaran,N.R. Kamini., High ethanol productivity from[6]周珺,肖冬光,郭學(xué)武,王艷混菌固定化發(fā)酵乳清生產(chǎn)燃料乙lactose by immobilized cells of Kluyveromyces fragilis and醇的研究[,釀酒科技,2008,1(163):42-44Zymomonas mobilis[J]. World Journal of Microbiology and7周珺,郭學(xué)武,王瑞生,肖冬光,岳瑞雪固定化酵母發(fā)酵乳清Biotechnology, 1991, 7(5): 551-556[3]Ozmihci, S, Kargi, F, EffectsM凵中國煤化工45131[8輕工業(yè)出版社continuous ethanol fermentation of cheese whey powder solutionCNMHG(CwP] Enzyme and Microbial Technology,200741:876-880.[9王亞楠等快速測定啤酒酒精度和真正發(fā)酵度的方法門釀Ozmihci, S, Utilization of cheese whey powd酒,2002,29(6):84-86(CWP) for ethanol fermentations: Effects of operating param-