熱帶醫(yī)學雜志2007年3月第7卷第3期[文章編號]1672-3619(2007)03-028503綜宗述生物分泌抗菌物質研究進展國果,吳建偉*(貴陽醫(yī)學院寄生蟲學教研室,貴陽550004)【摘要】分泌物是生物防御系統(tǒng)的組成之一,從最原始的植物到細菌、真菌、兩棲動物乃至高等級的哺乳動物,它們都能利用獨特的分泌物來維持自身的菌群平衡及抵御外物尤其是病原微生物入侵。本文從生物分泌物抗菌物質的分類及生物學特性、抗菌機理、應用及展望幾個方面對其進行了綜述關鍵詞】分泌物;抗菌物質;生物學特性;抗菌機理中圖分類號:R392.1文獻標識碼:A健康的生物有抵抗外物入侵的能力,經過漫長的種族芽孢桿菌( Bacillus subtilis)分泌物能產生具有抑制植物病進化,從最原始的植物到細菌、真菌、兩棲動物乃至高等級害能力的抗菌物質,推測屬于一些低分子抗生素8。目前的哺乳動物,各種生物體都形成了各自特有的防御系統(tǒng)來已發(fā)現了數十種細菌分泌型抗菌物質,包括乳酸菌產生的抵制病原微生物的侵入和維持自身的菌群平衡。因此乳酸鏈球菌肽( nisin)、萵苣苦素( lactacin)、片球菌素分泌物是生物防御系統(tǒng)不可缺少的組成之一,本文擬就各 pediocin),芽孢桿菌產生的枯草桿菌素( subtilin)、大桿菌種生物分泌物中抗菌物質的研究進展作一簡要綜述素( megacin),放線菌產生的納他霉素( natamycin)、聚溶素1分泌物中抗菌物質的分類及其生物學特征及一些食用菌產生的多糖類抗菌物質0。國內謝棟等從芽孢桿菌分泌物中分離到的抗菌蛋白98I,對輪紋病1.1植物分泌物抗菌物質菌、蘆筍莖枯病菌等多種植物病原菌有強烈的抑制作用植物分泌物主要來源于根系的直接分泌,也可以是健進一步研究發(fā)現其是一種相對分子質量為59000,含370康組織有機物的釋放或衰老的表面細胞和細胞內容物的個氨基酸殘基,等電點6.5,含糖、含脂肪酸的蛋白質,還具分解產物2。許多植物根系分泌物可通過對病原微生物種有相當高的熱穩(wěn)定性,抗蛋白酶K穩(wěn)定性。乳鏈球菌肽群的數量、生長、存活、趨化性、侵染力等抑制作用直接(nin)對大多數革蘭氏陽性菌有抑制作用,但對絕大多控制病毒的發(fā)生,還能通過影響其他微生物區(qū)系與病菌革蘭氏陰性菌和真菌沒有抑制作用:粘附于人類腸道的嗜產生拒抗而抑制病害發(fā)生?？嗥ぬ偎? Celastrus angulatus)乳酸桿菌LAl分泌的抗菌物質LA1-SCS,對革蘭氏陽性的根分泌物可以有效地防止病原細菌危害3;小麥根系菌和對革蘭氏陰性菌都有抑制作用2)分泌物能直接抑制小麥全蝕病原菌( Gaeumannomyces1.3昆蟲分泌物中的抗菌物質ainis)的菌絲發(fā)育4,蕎麥( Fagopyrum esculentum)的根昆蟲是自然界中最大的生物類群,其在進化過程中發(fā)系分泌物對小麥全蝕病菌也有明顯的抑制作用③S,但豆展了多種防御機制,包括昆蟲分泌并向體外釋放的體外化類、棉花( Gossypium arboreum)和茄子( Solanum melongena)學性防御物質,昆蟲的抗菌肽、凝集素及溶菌酶等體內分等的根系分泌物對黃萎輪枝霉( Verticilium)的抑制則是通泌的化學防御物質。體外防御性物質一般認為是在特殊腺過吸引黃藍狀菌(Tω talaromyces flavus)而間接起作用的∽。體(上鄂腺、唾腺、背腺、臀腺或附腺等)或腸道中合成分泌NGID等對多種植物根系分泌物的成分進行了研究,發(fā)到體外,體內抗菌物質主要在脂肪體合成,其他部位也有現其是多種成分的混合物,包括糖、氨基酸、有機物等初生少量合成等代謝產物及酚類等次生代謝產物。但到目前為止,植物分1.3.1苯醌類分泌物黃粉蟲( TeneborL)和琵琶泌物中具體是何種成分發(fā)揮抗菌作用少見報道。甲可通過部分外翻腹部防御腺釋放岀具刺激性氣味的有1.2細菌分泌物抗菌物質毒分泌物,該分泌物中的苯醌類防衛(wèi)化合物如2-甲基對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都可以分泌陽離苯醌(MBQ)和間甲酚具有抑制多種革蘭氏陽性、陰性菌和子和中性類的抗菌物質。1945年, JOHNSON首次報告枯草真菌的作用B。1.3.2肽類分泌物蜂毒肽()是由蜜蜂附腺特化基金項目:國家自然科學基金(N0.39970087);貴州省教育廳項目形成的毒腺分泌物,具有26個氨基酸殘基,包含一個親水(No.2003108)性、一個疏水性結中國煤化工鏈接區(qū)。與作者簡介:國果(1975~),女,講師,博士研究生,研究方向為昆蟲其他具有疏水性opin)相比蜂毒肽C-端具有CNMHG從蜜蜂屬的通訊作者:吳建偉,教授,E-mal:wjw@gme,edu.en意大利蜂( Ipis mellifera)、中華蜜蜂( Apis cerana)、大蜜蜂286·Journal of Tropical Medicine Vol 7 No 3 Mar 2007( Apis dorsata)和小蜜蜂( Apis florea)四個種中分離到數種道內,可隨著幼蟲分泌排泄物一起排出體外,推測這是活蜂毒肽,它們除具有殺菌活性外,還有裂解脊椎動物紅細的幼蟲能治療陳傷爛瘡的原因之·胞的作用。實蠅毒素( ceratotoxins)是一類在雄性地中海1.4兩棲動物及爬行動物皮膚分泌物抗菌肽實蠅生殖附腺分泌物中分離到的雄性特異性抗菌肽,對大在長期的自然選擇過程中,蛙類形成了由背部及腹部腸杄菌有著極強的抗菌活性,對藤黃微球菌(Miσ coccus皮膚分泌物來抵御有害環(huán)境因孑的侵襲。我國古代就已經lu!ews)具溶解作用。之后又在雌性實蠅附腺分泌物中分離對蛙形目蟾蜍科動物的分泌物進行利用。幾十年前從歐洲到4種抗菌肽即:實蠅毒素A、B、C、D。A、B抗菌肽均含有花鈴蟾( Bombina variegata)皮膚中發(fā)現了第一個兩棲類皮29個氨基酸殘基,并僅在第6位和第19位氨基酸殘基上膚抗菌多肽3。1987年從非洲爪蟾( Xenopus laevis)的皮膚存在差異,二級結構具有α螺旋構象。實蠅毒素A的中心中發(fā)現了另外一種抗菌多肽 magainin-,由于其具有廣譜區(qū)域(10-19)殘基發(fā)生螺旋化,構成抗菌肽旳中心,所有的的抗微生物活性(包括抗多種細菌、真菌、原蟲),受到了極極性氨基酸殘基分布于與α螺旋平行的區(qū)域,約占整個螺大的關注。在此以后,逐漸有 Blmbinin-like家族、 Bredinin旋表面的1/3,因此實蠅毒素具有親水脂性。實蠅毒素基家族和 Caern家族等陸續(xù)被發(fā)現,其中 Caern1-1的抗菌因不需誘導仍能正常表達,對革蘭氏陰性菌如大腸杄菌和能力最強。從結構上可以把兩棲類皮膚抗菌肽簡單地分為鼠傷寒沙門氏菌等具有殺菌活性μ兩大類,一類為線性α-螺旋多肽,它們不含二硫鍵:另1.3.3家蠅體外分泌物家蠅( Musca domestica vicina I)類是環(huán)性肽,其分子中含有由一對半胱氨酸組成的二硫幼蟲經常孳生于各種病原菌叢生的骯臟環(huán)境中,但其自身鍵。 Caern1有兩個螺旋,第1個螺旋是從第2位的L到第并不被病原菌所感染。人工飼養(yǎng)家蠅幼蟲的飼料富含多種1位的K,第2個從第17位的Ⅴ到第24位的H,連接這淀粉、蛋白質和維生素,但在溫度、濕度都適宜的條件下兩個螺旋的是一段多變的鉸合區(qū)。其中第15位的pro只要有足夠的幼蟲長于其中,飼料就不會長菌。這種極強基直接導致了肽的中間區(qū)域不能形成螺旋。此外,無論的適應惡劣環(huán)境的能力預示著它們在防御機制方面有著從N端或C端降解2個氨基酸殘基都會導致 Carin1家不同于其它種類昆蟲的獨特性質族的多肽抗菌活性喪失?，F有的研究表明,家蠅免疫防御性物質主要有兩個來蛇毒是爬行動物分泌物中研究得較多的一種,其主源:一是可誘導的幼蟲血淋巴15,二是幼蟲體外分泌物。要含有多種酶類和蛋白毒素,不同屬的蛇毒對金黃色葡EMos發(fā)現家蠅幼蟲中腸分泌泡分泌到腸絨毛表面旳萄球菌、大腸杄菌及嗜水氣單孢菌等均有抗菌作用。張景溶菌酶能消化細菌。張文吉等對幼蟲體外分泌物研究結海等發(fā)現四種蛇毒對革蘭氏陽性、陰性菌有抗菌活性果表明,它具有抑制多種植物革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性同時也證實了有抑菌作用的物質是蛇毒中的L-氨基酸氧菌及毛霉生長的作用,抑菌譜相當廣。初步提純后顯示,其化酶,酶活力越高,抑菌活性越強熔點為60~100℃,最大紫外吸收在210mm左右。經高壓液1.5哺乳動物分泌物抗菌肽一防御素相色譜分析,含有5種成分,初步官能團驗證表明不含糖防御素具有廣泛的抗細菌、真菌和病毒的活性。哺乳可能含有α氨基酸、伯胺或羥基胺等。吳建偉博士嶍對家動物防御素有α防御素和β防御素兩種,其中β防御素是蠅幼蟲生態(tài)處理豬糞后豬糞中菌群數量變化進行了研究,由上皮細胞合成,分泌進入消化道、皮膚和傷口等與空氣接亦發(fā)現幼蟲分泌排泄物中含有抗大腸杄菌的物質,并且觸的粘液中,屬于分泌型防御素。它由38-42個氨基酸殘基抗菌物質至少可在糞渣中維持到第8天,121℃30min可組成,60%~70%是保守的,相對分子質量4000-600左使其滅活。張財興等分別用三種方法提取家蠅幼蟲分泌右,分子中含有6-8個Cys殘基,形成3-4對分子內二硫物,抗菌活性試驗證明對大腸杄菌、金黃色葡萄球菌、枯鍵,具有穩(wěn)定的分子結構和廣譜的抗菌活性。β防御素草杄菌和白假絲酵母菌均有抑制作用,同時,分泌物還具在宿主呼吸道防御中起著重要的作用。有殺根結線蟲的效能。分泌物大部分呈中性至弱堿性.少部分為弱酸性,等電點為8.05。我實驗室經過長期的研2抗菌物質的抗菌機理究,發(fā)現該分泌物對寄生蟲卵(豬蛔蟲卵)的發(fā)育有一定不同來源的抗菌物質,抗菌途徑不一樣。2-甲基對苯的抑制作用m。我們后續(xù)使用凝膠層析等分離純化方法從醌(MBQ)抑菌機理可能是刺激其代謝物對供試菌DNA的該分泌物中純化到3個抗菌組分,均具有廣譜抗菌活還原型輔酶I造成損傷,而對甲酚則與其分子結構上具有性,對蛋白酶不敏感,耐高溫和反復凍溶促進該物質進入細胞的羥基,提高了油脂的硫代巴比妥酸除上述物質外,日本學者從家蠅幼蟲分泌物中提煉出反應物的反應水平和誘導膜流體性改變的作用有關,但具了一種尿囊素,含量雖小,卻有殺菌防腐、抗氧化的作用。體抑菌機理尚需進一步研究3。抗菌肽類物質對病原菌的純品是無臭無味的白色結晶體,相對分子質量1582,熔點抗菌機理研究得比較多,但目前還沒有一個涵蓋所有抗菌大于220℃,微溶于冷水,人工合成后可廣泛運用于醫(yī)藥肽作用機理的理輕工、日化等方面。另外,家蠅幼蟲體內還存在一種糞產堿過細菌細胞膜后V山中國煤化工D抗穿菌),有抑制病原菌的作用。這種堿菌存在于蠅幼蟲消化RNA和蛋白質的CNMHG膜上打孔導致細胞膜通透性增大,破壞細胞膜的完整性后菌絲原生熱帶醫(yī)學雜志2007年3月第7卷第3期287質體從胞壁破壞處泄漏,菌絲斷裂,孢子及菌絲畸形繼而細3] WENJUN W, MINGAN W, WENMING Z,etal. Insecticidal菌溶解;③阻斷細胞膜組分合成或者抑制細菌呼吸導致Celastrus angulatus [JI靶細胞死亡∞;④作用于宿主細胞,激活機體免疫功能(3Phytochemistry,2001,58(8):1183-1187抗菌肽對細菌、病毒甚至寄生蟲有抑制作用,但它對[4] SMILEY RW, COOK RJ. Relationship between take all wheat人體是安全的,對于高等動物無毒,因為高等動物的細胞and rhizosphere pH in soils fertilized with ammonium vs, nitratenitrogen[J]. Phytopothol, 1973, 63: 882-890骨架完整、修復快,故不會造成最終的損傷。[5] SHUMAN LM, WANG J. Elfect of rice variety on zine3抗菌肽類物質的應用及展望cadmium, iron, and manganese content in rhizosphere and nonrhizosphere soil fractions [J]. Commun Soil Sci Plant A nal20世紀20年代以來發(fā)現的抗生素,對人類的健康作出了巨大的貢獻。但隨著抗生素的大量使用,微生物耐藥[6]熊平,宋光煜根分泌物對根際微生物生態(tài)分布性增強的問題日漸突岀,尋找新的抗菌資源已成為備受關的影響[J.土壤通報,2002,33(2):145-148注的焦點。生物抗菌蛋白/抗菌肽抗菌機理與青霉素等抗[7 INGID K, RAFFIZY K, Soluble root exudates df maizeInfluece of potassium supply and rhizosphere microyanism [J]菌機制不同,后者是通過阻斷大分子的生物合成來發(fā)揮作Soil biol biochem. 1984. 16: 315-322用,而抗菌肽獨特的抗菌機理不易使微生物產生耐藥性,[8]王岳.抗生素[M].北京:科學出版社,1986:453-471.能直接殺死多種微生物基至病毒、腫瘤和寄生蟲,同時9]劉毅,寧正祥,天然食品防腐劑-抗菌肽[J.食品科學,還能加速機體免疫和傷口的愈合過程。對真核生物無致畸作用、無毒性,也不易產生耐藥性。因此,可以根據抗菌肽[10] OUWEHAND AC. Antimicrobiac components from lactic acid結構與功能的研究,進行新的抗菌肽設計與改造,尋cteria[M 1//SALMINEN S, VON WRIGHT A ved Lacticacid bacteriami crobiology and functional aspects [M]. Second些具有抗細菌、真菌、病毒乃至腫瘤細胞的新型抗菌物質,edition. New York: Marcel Dekker. 1998: 139-159為新藥的開發(fā)提供新途徑11]謝棟,彭憬,王津紅.枯草芽孢桿菌抗菌蛋白X8Ⅲ的純化目前,國內外對利用抗菌肽來研究生產新型抗菌藥物倍加重視。來源于乳酸鏈球菌的乳鏈菌肽治療奶牛奶頭皮「1] BERNET- CAMARD ME, LIEVIN V, BRASSART D,etal.膚局部感染時,lmin內就可殺死金葡菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌等病原菌,且無不良反應,現其已進入臨床實honbacteriocin antibacterial substance(s )active in vitro and in驗階段3。從兩棲動物爪蟾( Xenopus laeuis)皮膚分泌物中[J. Appl Envir Ml,1997,63:2747-2753.發(fā)現的爪蟾抗菌肽 Maganins現已應用于治療人皮膚感染[13]強承魁,楊兆芬,杜予黃粉蟲防御性分泌物抑菌活性的研究[J].生物技術,2006,16(1)三期臨床實驗階段。加拿大的 Intra biotics公司利用從蠶14]張豁中,聞玉麟動物活性成分化學[M].第1版.天津:天或牛分離到的抗微生物肽( Protegrin)I開發(fā)出一種抗細津科學技術出版社,1995:616-625和真菌的口服藥劑,通過噴霧用于呼吸道感染及口腔粘膜15]趙瑞君,劉成芳,董建臻,等家蠅抗菌肽的誘導提取及篩選炎的治療,取得了較好的療效3。至于蠅幼蟲,國內外已J]熱帶醫(yī)學雜志,2005,5(2):193-194經有將蛆蟲應用于感染創(chuàng)面的修復治療并取得良好的效16 LEMOS FJA. Bacteria-digesting midgut-lysozyome from Musca果柳,稱其為蛆清創(chuàng)療法或生物擴創(chuàng)療法。metica( Diptera)Larvae, Purification properties and secretarymechanism [J]. Insect Biochem Mol Biol, 1993, 23(4): 533當然,抗菌肽的發(fā)展和應用還存在以下問題:①天然抗菌肽來源極有限,大規(guī)模開發(fā)的途徑亟待解決;②目前[17]張文吉,明九雪,羅紀臺.家蠅幼蟲分泌物防治植物病害研對抗菌肽的毒性、免疫原性及藥動學和藥效學等的研究依究簡報[J.植物保護學報,1994,21(1):90-9據還較少,臨床試驗有待加強;③抗菌肽在生產、保存、運18]吳健偉.家蠅幼蟲生態(tài)處理豬糞的效果研究[D].上海第輸過程中如何確保活性。但是,我們相信,隨著對抗菌肽在醫(yī)科大學博士后論文,2000:18-21理論和應用上的全面研究開發(fā),抗菌肽必將最終作為一類19]張財興朱開建楊亞東舍蠅幼蟲分泌物及血淋巴活性研新型藥物對人類的健康產生深遠的影響究[J]廈門大學報(自然科學版),2001,40(6):1301-130520]國果,吳建偉.家蠅幼蟲分泌物對豬蟈蟲卵發(fā)育的影響[J]」貴陽醫(yī)學院學報,2002,27(2):134-1[參考文獻][21]國果,吳建偉.家蠅幼蟲分泌物抗菌組分抗菌效果觀察及[1 FAGE I, PYE A, RASMUSON T, et al. Insect immunity. 11篩選[J].國際醫(yī)學寄生蟲病雜志,2006,33(1):6-9Simultaneous induction of antibacterial activity and selection22]丁有真,張書芳,高錦亞,等.家蠅幼蟲體內的糞產堿菌有of some hemolymph proteins in diapausin抑菌能力[J].中國媒介生物學及控制雜志,1997,8(3)181-1831975,12:1426-1438[23] RINALDI AC. Antimicrobial peptides from amphibian skin: an[2 LILJEROTH E, BAATH E, MATHIASSON I, et al. 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