第30卷第3期長(zhǎng)江工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)Vol 30 No. 32013年9月Journal of Changjiang Engineering Vocational CollSep.2013PCR技術(shù)的研究及應(yīng)用張?jiān)S文琦(華東理工大學(xué),上海200237)摘要:PCR技術(shù)是一種在體外對(duì)特定DNA序列進(jìn)行快速擴(kuò)增的技術(shù)。因其較強(qiáng)的特異性和靈敏度以及檢測(cè)速度快準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)、微生物檢測(cè)等許多領(lǐng)域。本文從PCR技術(shù)的原理、分類(lèi)及應(yīng)用方面進(jìn)行了綜述,并對(duì)其發(fā)展做出了展望。關(guān)鍵詞:PCR技術(shù);水產(chǎn);微生物中圖分類(lèi)號(hào):Q50文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):16730496(2013)03000404Research and application of PCr technologyZHANG XU Wen-qiEast China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)Abstract: PCR technology is to rapidly amplify certain dna sequence in vitro. Because of its multiple advantages such as strong specificity, sensitivity, quick detection with high accuracy, etc,PCR has been applied to plenty of fields including detecting aquatic products and microorganism.The review of PCR's principles, classification as well as application, and also preview of its futuredevelopment are made here.Key words: PCR; aquatic product; microorganism點(diǎn),實(shí)現(xiàn)在體外對(duì)特定DNA序列進(jìn)行快速擴(kuò)增,可0前言在短時(shí)間內(nèi)在試管中獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異DNA序列拷貝。PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠,并被世界各分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子國(guó)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、考古學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的基因的功能、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及其重要性和規(guī)律性的科學(xué),研究和分析,對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了革命性的經(jīng)過(guò)幾十年的迅速發(fā)展已成為人類(lèi)從分子水平上真影響。發(fā)明人 Kary Banks Mulls也因此榮獲1994正揭開(kāi)生物世界的奧秘,由被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)2。主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。分子生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容包含四個(gè)方面DNA重組技術(shù),基因表1PCR技術(shù)的原理達(dá)調(diào)控研究,生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究,基因組功能基因組與生物信息學(xué)研究。隨著分子生物學(xué)PCR技術(shù)是根據(jù)待擴(kuò)增的已知DNA片段序的迅速發(fā)展,相關(guān)的研究技術(shù)日臻完善,幾乎滲透到列、人工合成與該DNA2條鏈末端互補(bǔ)的2段寡核生命科學(xué)的全部領(lǐng)域。本文主要介紹PCR技術(shù)苷酸引物,在體外將待檢DNA序列(模板)在酶促PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Polymerase Chain Re作用下進(jìn)行擴(kuò)增。PCR的整個(gè)技術(shù)過(guò)程經(jīng)若干個(gè)action,PCR)是1985年由美國(guó) PE-Cetus公司的科循環(huán)組成,一個(gè)循環(huán)包括連續(xù)的3個(gè)步驟學(xué)家 Kary Banks Mulls發(fā)明的一種可在體外快速第1步是高溫條件下的DNA模板變性,即模擴(kuò)增特定基因或DNA序列的技術(shù)。這項(xiàng)新技術(shù)是板DNA在93~94℃的條件下變性解鏈根據(jù)生物體內(nèi)DNA序列能進(jìn)行快速?gòu)?fù)制的某些特第2步是退火,即人工合成的2個(gè)寡核苷酸引物與模板DN中國(guó)煤化工退火;收稿日期:2013-0426作者簡(jiǎn)介:張?jiān)S文琦(1992),女,武漢人,大學(xué),主要從事環(huán)境工程專(zhuān)第3步CNMH(物同時(shí)存在業(yè)研究的情況下,借助 TaqDNA聚合酶的作用,引物鏈將張?jiān)S文琦PCR技術(shù)的研究及應(yīng)用沿著5’-3’方向延伸與模板互補(bǔ)的新鏈。經(jīng)過(guò)引物的GC含量則應(yīng)與其類(lèi)似。一般情況下,設(shè)計(jì)這個(gè)循環(huán)后,合成了新鏈,可將其作為DNA模板繼引物時(shí),G+C堿基對(duì)含量以40%~60%為佳,解鏈續(xù)反應(yīng),由此循環(huán)進(jìn)行。溫度高于55℃。避免引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)等二循環(huán)進(jìn)程中擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)級(jí)方式增加,級(jí)結(jié)構(gòu),尤其是兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,尤般單一拷貝的基因循環(huán)25~30次,DNA可擴(kuò)增其是在引物的3’末端,即使無(wú)法避免,其3’端的互100萬(wàn)~200萬(wàn)倍。PCR反應(yīng)的步驟很簡(jiǎn)單但補(bǔ)堿基也不能多于2個(gè),以減少“引物二聚體”的形是具體的操作是復(fù)雜的,如退火溫度的確定、延伸時(shí)成,否則會(huì)影響靶DNA序列的擴(kuò)增。在合成新鏈間的長(zhǎng)短以及循環(huán)數(shù)等。因此,不同的反應(yīng)體系應(yīng)時(shí),DNA聚合酶將單核苷酸添加到引物的3·末端,該確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件,以避免假陰性或假陽(yáng)性等因此引物3端的5~6個(gè)堿基與靶DNA片段的配情況的產(chǎn)生。對(duì)必須精確、嚴(yán)格。在PCR反應(yīng)中,引物的適宜濃度為0.1~12PCR反應(yīng)基本成分(mol/L)。引物濃度過(guò)高,容易形成非特異性擴(kuò)增,引物濃度過(guò)低,不足以完成30個(gè)循環(huán),降低PCR的2.1模板DNA產(chǎn)量。通常模板DNA的量較多或高度復(fù)雜DNAPCR反應(yīng)的模板可以是單鏈或雙鏈DNA,可如人類(lèi)基因組DNA作模板時(shí),引物濃度應(yīng)低一些以是基因組DNA或CDNA,mRNA也可作為PCR模板DNA的量較少或低度復(fù)雜DNA如質(zhì)粒DNA的模板,只需用逆轉(zhuǎn)錄酶把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作模板時(shí)引物濃度應(yīng)高一些。即可。由于PCR反應(yīng)的特異性由寡聚核苷酸引物2.3 dNTPs決定,模板DNA不需要高度純化,但應(yīng)避免任何蛋dnTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)是PCR白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、能結(jié)合DNA的反應(yīng)中靶DNA序列擴(kuò)增的原料。在PCR反應(yīng)中蛋白質(zhì)及多糖類(lèi)物質(zhì)的污染。選用純化的DNA做每種脫氧核苷三磷酸的濃度以50~200gmol/L為模板,可增加模板分子的濃度,除去可能抑制PCR宜,不能低于10~15pmol/L。濃度過(guò)高易引起非特反應(yīng)的雜質(zhì)如SDS會(huì)嚴(yán)重抑制 TaqDNa聚合酶的活性,可顯著提高PCR擴(kuò)增的有效性。通常,模板異性PCR產(chǎn)物,當(dāng)dNTP濃度高于50mmo/L時(shí)還DNA保存于10mmol/ L Tris-HCl(pH7.6)、0會(huì)抑制Taq酶的活性;濃度過(guò)低則影響擴(kuò)增產(chǎn)量。mmol/ L EDTA(pH8.0)緩沖液中5。4種dNTP的摩爾濃度應(yīng)相同,不平衡的濃度會(huì)導(dǎo)2.2引物致堿基錯(cuò)配率上升,降低合成速度,導(dǎo)致反應(yīng)過(guò)早終PCR引物是一段與待擴(kuò)增的目標(biāo)DNA序列側(cè)1。在10u的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中,濃度5mol/L翼片段互補(bǔ)的寡核苷酸片段,長(zhǎng)度大多為10~30個(gè)和200mo/L的dNTP就足以分別合成6.5g和堿基。通常,一對(duì)引物包含5’端與正義鏈互補(bǔ)的寡Ag DNAL5]核苷酸片段和3端與反義鏈互補(bǔ)的寡核苷酸片段,24DNA聚合酶這兩個(gè)寡核苷酸片段在模板DNA上的結(jié)合位置之在100的PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中, Taq dnA間的距離決定PCR擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度聚合酶的常用濃度為1~2.5U,人類(lèi)基因組DNA根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算,長(zhǎng)約17個(gè)堿基的寡核苷酸序作模板時(shí), Taq dna聚合酶的適宜濃度范圍為1~列在人類(lèi)基因組中可能出現(xiàn)的概率為1次。因此,4U。酶量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致增加非特異性PCR產(chǎn)物,反只要引物不少于16個(gè)核苷酸,就能保證PCR擴(kuò)增之會(huì)引起PCR產(chǎn)量不足。 Taq dna聚合酶作用時(shí)序列的特異性。引物過(guò)長(zhǎng)往往會(huì)降低其與模板的雜需要Mg2,每次擴(kuò)增反應(yīng)必須確定最佳Mg2濃交效率,從而減低PCR的反應(yīng)效率度。 Pfu dNa聚合酶是一種具有高保真性能的高PCR反應(yīng)成功的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)最佳的引物。引溫DNA聚合酶來(lái)源于高溫嗜熱菌,分子量為物設(shè)計(jì)的先決條件是與引物結(jié)合的靶DNA序列必90kDa,適用于一般的PCR反應(yīng)、基因克隆與表達(dá)須是已知的,與兩個(gè)引物結(jié)合的序列之間的靶DNA基因突變分析、全基因合成等。除 Taq dna聚合序列則未必清楚。設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)盡可能選擇堿基隨酶、 Pfu dna聚合酶外,常見(jiàn)的DNA聚合酶還有:機(jī)分布的序列,盡量避免多嘌呤、多聚嘧啶或其他異 Tth dNA聚中國(guó)煤化工DNA聚合常序列。兩個(gè)引物中G+C堿基對(duì)的百分比(G+酶, Platium FCNMHGDNA聚合酶C%)應(yīng)盡量相似,若待擴(kuò)增序列中GC含量已知時(shí),(高保真)等s013年9月長(zhǎng)江工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)第30卷第3期2.5緩沖液線12。熒光信號(hào)在指數(shù)擴(kuò)增階段,PCR產(chǎn)物熒光信PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液通常含有10mmol/號(hào)的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性對(duì)應(yīng)關(guān)系LTris-HCIe(pH8.3),50mmo/LKCl和1.5mmo/然后進(jìn)行定量分析1。MGcL2,基本適用于各種模板、寡核苷酸引物,但對(duì)3.1多重PCR技術(shù)某種模板與引物的特定組合就不一定最佳,用時(shí)需多重PCR( multiplex PCr)技術(shù)是PCR技術(shù)的再作適當(dāng)調(diào)整。種,為同一管中加人多對(duì)特異性引物,與PCR管26Mg2+及其它成分內(nèi)的多個(gè)模板反應(yīng),在一個(gè)PCR管中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)PCR反應(yīng)體系中Mg2的濃度十分重要,適宜目標(biāo)DNA分子。多重PCR技術(shù)可以擴(kuò)增一個(gè)物的Mg2濃度為高于dNTP總濃度0.5~2.5mmol/種的一個(gè)片段,也可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)物種的不同片L。當(dāng)dNTP濃度為0.2 mmol/L時(shí),建議Mg2的段濃度為1mmol/L。Mg2+濃度過(guò)高,容易生成非特在同一反應(yīng)體系中,多重PCR技術(shù)進(jìn)行多個(gè)位異性擴(kuò)增產(chǎn)物;反之,濃度過(guò)低會(huì)使PCR產(chǎn)量降低。點(diǎn)的特異性擴(kuò)增時(shí),引物間的配對(duì)、引物間的競(jìng)爭(zhēng)性Mg2的有效濃度受到高濃度的螯合劑如EDTA、高擴(kuò)增等會(huì)對(duì)擴(kuò)增效果產(chǎn)生重要影響。一方面,如果濃度的帶負(fù)電荷離子基團(tuán)如磷酸根的影響,它們可能選擇適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,可極大地提高與Mg2+結(jié)合從而降低Mg2的有效濃度。因此,每多重PCR的擴(kuò)增效果15。主要包括退火溫度、退當(dāng)首次使用靶序列、引物、dNTP(含磷酸根)的新組火及延伸時(shí)間、PCR緩沖液成分、dNTP的用量、引合時(shí),都要將Mg2濃度調(diào)至最佳。通常的方法是物及模板的量等。另一方面,DNA的抽提質(zhì)量也影設(shè)置一組反應(yīng),每一反應(yīng)的KCl(50mmo/L)和Tris響多重PCR擴(kuò)增效率。如DNA抽提不干凈或降HCl(10mmol/L)濃度相同,而MgCl2濃度不同解都將影響PCR擴(kuò)增效果6)。(0.05~5mmol/L),每次增加(0.5mmol/L),反應(yīng)3.3單分子PCR技術(shù)(SM-PCR)結(jié)束后,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電單分子PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上泳來(lái)比較各反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的量,從中選出最佳的發(fā)展的,基本循環(huán)過(guò)程相同,但在反應(yīng)條件、模板數(shù)Mg2濃度量、DNA聚合酶選擇、引物設(shè)計(jì)方面具有不同點(diǎn)該技術(shù)是以少量或單個(gè)DNA分子為模板進(jìn)行的3PCR技術(shù)的分類(lèi)PCR。單分子PCR技術(shù)反應(yīng)中,DNA模板濃度極低3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)這就要求模板有較高的質(zhì)量,這是試驗(yàn)成敗的決定1996年,學(xué)者經(jīng)過(guò)研究,在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基性因素。在設(shè)計(jì)引物時(shí),應(yīng)該嚴(yán)格控制GC的含量礎(chǔ)上,首創(chuàng)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),新技術(shù)已經(jīng)和T值,同時(shí)盡量避免引物間存在可配對(duì)序列。在應(yīng)用至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、分子生物學(xué)和其他基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。反應(yīng)混合物模板數(shù)極低的情況下,若引物之間存在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)基于傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì),還具少量配對(duì)序列擴(kuò)增時(shí)極易形成二聚體,使反應(yīng)無(wú)法有實(shí)時(shí)性、準(zhǔn)確性、無(wú)污染,實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作和多重進(jìn)行,得不到所需要的產(chǎn)物。由于單分子PCR技術(shù)反應(yīng),是PCR技術(shù)研究史上從定性到定量的飛躍。反應(yīng)的變性溫度(96~98℃)大多比常規(guī)PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)最大的特點(diǎn)是能將熒光基(94℃)略高,因而對(duì)DNA聚合酶熱穩(wěn)定性的要求團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中,借助于熒光信號(hào),累積也更加嚴(yán)格,需要有較好的熱穩(wěn)定性,以防止溫度過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知高而使其失活。其變性時(shí)間(5~15s)、退火時(shí)間及模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)這一特點(diǎn)是常規(guī)延伸時(shí)間也短于常規(guī)PCR技術(shù)。PCR技術(shù)所不具有的,因?yàn)槠鋵?duì)擴(kuò)增反應(yīng)不能進(jìn)行隨時(shí)的檢測(cè)。常規(guī)PCR技術(shù)的擴(kuò)增終產(chǎn)物需要在凝膠電汰等條件下才能進(jìn)行無(wú)法對(duì)起始模板進(jìn)行4PCR技術(shù)的應(yīng)用準(zhǔn)確的定量,而熒光定量PCR技術(shù)的反應(yīng)進(jìn)程可以4.1PCR技術(shù)在水產(chǎn)上的應(yīng)用根據(jù)熒光信號(hào)的變化做出準(zhǔn)確的判斷0-1。一個(gè)基因表達(dá)是檢測(cè)某個(gè)基因在不同發(fā)育期或不同PCR循環(huán)反應(yīng)結(jié)束之后,定量PCR儀可以收集1組織中的表達(dá)中國(guó)煤化工處理過(guò)程中個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化可以反映產(chǎn)的影響而出現(xiàn)CNMH學(xué)者應(yīng)用real物量的變化情況這樣就可以得到1條熒光擴(kuò)增曲 time PCr技不餅旯咴水化合初量對(duì)翹嘴紅鮑張?jiān)S文琦PCR技術(shù)的研究及應(yīng)用糖代謝酶G6Pase、GK以及 PEPCK表達(dá)量的影表達(dá)差異[D曲阜:曲阜師范大學(xué),2011響13-),研究結(jié)果可為翹嘴紅鮐飼料配方中的最合[4]常世敏PCR在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用邯鄲農(nóng)適糖含量提供理論依據(jù)。孫淑娜等2研究葉酸拮業(yè)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào),200,.1(4):2325.抗劑對(duì)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2b及HAS2[5]鄭景生呂蓓.FCR技術(shù)及實(shí)用方法[J].分子植物育種,2003,1(3):382.表達(dá)的影響,表明葉酸拮抗劑對(duì)早期胚胎的心臟發(fā)[6] Krawetz S. A,PonR.T., and dixon g,H,lh育影響較大,可導(dǎo)致斑馬魚(yú)心臟發(fā)育延遲及心臟形 creased efficiency of the Taqpolymerase catalyzed polymerase態(tài)異常,并下調(diào)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2 b chain reaction, Nucleic Acids,Res,1989,17,819及HAS2的表達(dá),這可能是葉酸生物學(xué)活性受抑后[7]金冬雁等(譯),分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版北京:科導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的機(jī)制之一。 Sawyer et al2以學(xué)出版社,19934+342.5657,.7262斑馬魚(yú)的未受精卵、胚胎、仔魚(yú)和成魚(yú)為研究材料,[8] KUBISTA M, ANDRADE J M, BENGTSSON M,etal. The real-time polymerase chain reaction [JJ. Molecular采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),檢測(cè)了P450 aroma Aspects of medicine,.00.723):9515和P450 aromA在不同組織的表達(dá)量,表明在各組織[9 AGINdOTAN BO, SHIEL P J, BERGER P H. Simul-中均有2種基因的表達(dá),但表達(dá)量顯著不同,呈現(xiàn)組 taneous detection of potato viruses,PLRv,PvA, PVX and織特異性。PVY from dormant potato tubers by Taq Man real-timeRT4.2PCR技術(shù)在微生物檢測(cè)上的應(yīng)用PCRD]. J Viral Methods, 2007, 142(1-2): 1-91990年, Bej et a2在利用多重PCR的方法檢[10]李麗平.小麥慢銹品種葉片受條銹菌侵入后的木質(zhì)素合成及調(diào)控研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2009測(cè)了 Legionella類(lèi)菌種和大腸類(lèi)細(xì)菌,其結(jié)果是通[1]薛霜等實(shí)時(shí)熒光定量FCR技術(shù)研究進(jìn)展及其在過(guò)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)方法固定的多聚dT尾捕捉探針和生物素獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[門(mén)中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,(7):111標(biāo)記的擴(kuò)增DNA進(jìn)行雜交來(lái)檢測(cè)的。張志東等檢[12] SCHUBERT J, FOMITCHEVA V, SZTAINGRET測(cè)口蹄疫病毒(FMDV)持續(xù)性感染的帶毒動(dòng)物,表 WISNTEWSKAJ. Differentiation of Potato virus y strains u明實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有快速檢測(cè)、準(zhǔn)確、客 ing improved sets ofdiagnostic-PCRPCR- primers[J].J VirolMethods,2007,140(1-2):6674.觀等優(yōu)勢(shì),優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法243。 Metzger[t3]袁繼紅實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究[J現(xiàn)代Bodden et a1對(duì) PCR-ELISA的方法進(jìn)行了評(píng)價(jià),農(nóng)業(yè)科技,2010,(1322結(jié)果顯示樣品中沙門(mén)氏菌的檢出率可以達(dá)到98%[14]朱善元生物檢測(cè)技術(shù)PCR及其在獸醫(yī)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J.黑龍江畜牧獸醫(yī),199,(11):21-22.[15]黃銀花等影響多重PCR擴(kuò)增效果的因素[J.遺傳5結(jié)語(yǔ)2003,25(1):6568PCR技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)16陳諾等多重PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)的靈魂,掌握PCR技術(shù)是進(jìn)人分子生物學(xué)研究的鑰[17]劉連生常規(guī)PCR技術(shù)與單分子PCR技術(shù)[醫(yī)學(xué)匙。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速發(fā)展、科學(xué)技術(shù)的信息,2010,23(11:4379438不斷進(jìn)步,PCR實(shí)驗(yàn)方法將變得更加簡(jiǎn)單、快速、有18]唐永凱等翹嘴紅鮑肝臟G6Pase催化亞基的克隆以效。PCR技術(shù)正向著簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用、低成本、高及攝食和飼料中碳水化合物對(duì)其表達(dá)的影響[水產(chǎn)學(xué)報(bào),質(zhì)量、智能化的方向發(fā)展同時(shí)PCR技術(shù)的應(yīng)用也200.3101453將不斷深入到人類(lèi)涉及的各個(gè)方面,甚至進(jìn)入尋常19]劉波等高碳水化合物日糧對(duì)翹嘴紅舶生長(zhǎng)、GK及 GK mRNA表達(dá)的影響[J.水生生物學(xué)報(bào),2008,32(1):家庭中47-53在如今的環(huán)境保護(hù)工作中,生物處理是最常被20]俞菊華,等碳水化合物脂肪對(duì)翹嘴紅館 PEPCK基運(yùn)用的方法,利用各種方法,我們可以根據(jù)需求去培因表達(dá)的影響門(mén)].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2007,31(3):369373育、改造微生物,讓它們?yōu)槲覀兯?。[21]孫淑娜,等.葉酸拮抗劑甲氨喋呤導(dǎo)致斑馬魚(yú)心臟發(fā)育異常及BMP2bHAS2表達(dá)下調(diào)[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志參考文獻(xiàn):2007,9(2):159-163[1]覃擁靈.分子生物學(xué)技術(shù)及其在環(huán)境污染治理中的應(yīng)[ 22] SAWYER S J, GERSTNER K A, CALLARD G Real-用研究進(jìn)展[J.河池學(xué)院學(xué)報(bào),2005,25(2):24time pCR analysis of cytochrome P450 aromatase expression in[2]張晶,張惠文張成剛實(shí)時(shí)熒光定量PCR及其在微zebra fish: gene specific tissue distribution, sex differences, devel生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用[J.生態(tài)學(xué)報(bào),20025(6):1445- omental programming; and estrogen regulation[J ]. General and中國(guó)煤化工71450.[3]謝海燕黑線倉(cāng)鼠LHR部分序列克隆及組織器官的CNMHG下轉(zhuǎn)第12頁(yè))2013年9月長(zhǎng)江工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)第30卷第3期現(xiàn)的較大拉應(yīng)力,最大拉應(yīng)力為1.88MPa。工時(shí)未按設(shè)計(jì)要求預(yù)留收縮縫,大壩為全年施工,溫從以上計(jì)算結(jié)果來(lái)看,大壩壩體主壓應(yīng)力均小控措施也未達(dá)到設(shè)計(jì)要求,再加上1991年和1997于砌體的容許壓應(yīng)力6.0MPa,故滿足規(guī)范要求。年都遭“低溫+高水位”的不利荷載組合。裂縫削弱工況1、工況2、工況5得到的大壩壩體主拉應(yīng)力略拱的作用且增大了壩體揚(yáng)壓力,導(dǎo)致壩體應(yīng)力重大于計(jì)算拉應(yīng)力參考值。究其原因,主要是《砌石壩分布。目前兩支測(cè)縫計(jì)測(cè)值受氣溫影響較小,但隨設(shè)計(jì)規(guī)范》(SL25-2006)要求按照《混凝土拱壩設(shè)計(jì)著時(shí)間的推移略有增大跡象,應(yīng)加強(qiáng)觀測(cè)規(guī)范》(SL282-2003)的要求,有限元法計(jì)算成果應(yīng)(3)結(jié)構(gòu)計(jì)算分析表明,大壩砌體主應(yīng)力在各種補(bǔ)充計(jì)算“有限元等效應(yīng)力”,而本計(jì)算成果中存在工況下主壓應(yīng)力均滿足規(guī)范要求,大壩壩體主拉應(yīng)應(yīng)力集中現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)應(yīng)力集中部位的節(jié)點(diǎn)應(yīng)力補(bǔ)力基本滿足規(guī)范要求?？紤]到拱壩的受力特性,其充計(jì)算有限元等效應(yīng)力,可知壩體主拉應(yīng)力在基本結(jié)構(gòu)安全基本滿足規(guī)范要求。荷載組合(工況1~工況4)時(shí),小于1.20MPa;特殊荷載組合(工況5)時(shí),小于1.50MPa。故總體計(jì)算參考文獻(xiàn):得到的強(qiáng)度結(jié)果基本滿足規(guī)范要求。[1]馬福恒,劉成棟.安徽省黃山市毛坦水電站大壩安全綜合評(píng)價(jià)報(bào)告[R]南京:南京水利科學(xué)研究院,2004[2]程云峰毛坦水電站砌石拱壩裂縫的環(huán)氧灌漿[].小4大壩結(jié)構(gòu)安全性態(tài)評(píng)價(jià)水電,2002,(5):15~16[3]砌石壩設(shè)計(jì)規(guī)范SIL25-2006(1)變形觀測(cè)資料分析表明,大壩壩體位移變化[4]混凝土拱壩設(shè)計(jì)規(guī)范SL28200符合拱壩的一般變形規(guī)律,大壩變形整體協(xié)調(diào)性好。[5]周磊等.毛坦砌石拱壩應(yīng)力和變形分析[門(mén)水電能(2)經(jīng)分析,壩體裂縫產(chǎn)生的主要原因是壩體施源科學(xué),2009,(3):67~70.·@····················aa·小·····a··,·,·······合·(上接第7頁(yè))of virologicalMethods, 2003, 111(2):95-100[23] BF3 A K, MAHBUBANI M H, MILLER R, et al. [25] ZHANG Z D, BASHIRUDDIN J B Quantitative analy-Multiplex PCR amplificationand immobilized capture probes sis of foot-and-mouth disease virus RNa duration in tissuesfor detection of bacterial pathogens and indicators in water of experimentally infected pigs[JJ. The Veterinary JournalJ]. Mol cell probes,1990,4(5):353-365.2009,180(1):130-132.[24] ZHANG Z D, ALEXANDERSEN S Detection of carri- [26] METZGER- BODDIEN C, BOSTEL A, KEHLE J. Sal-er cattle and sheep persistently infected with foot-and-mouth monella sp. PCR-ELISAforanalysis offood samples [J].Jdisease virus by a rapid real-time RT-PCRassay[J] Journal Food Prot, 2004, 67(8): 1585-1590中國(guó)煤化工CNMHG