聚乙二醇修飾干擾素a 2b的穩(wěn)定性研究姚文兵,林碧蓉,沈子龍,吳梧桐(中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥學(xué)院江蘇南京210009 )摘要:目的研究聚乙二醇修飾干擾素a 2b的穩(wěn)定性。方法以抗病毒活性為指標(biāo)考察單修飾干擾素a 2b、多修飾干擾素a2b和干擾素a2b的穩(wěn)定性(4C、25C、37C)抗胰蛋白酶水解能力和37C人血清穩(wěn)定性。結(jié)果在4C、25C和379C條件下穩(wěn)定性依次為多修飾干擾素a2b>單修飾干擾素a2b>干擾素a 2b。抗胰蛋白酶水解試驗(yàn)表明:干擾素a2b在30min時(shí)抗病毒活性迅速降到原來的7.1%單修飾干擾素a2b剩余50%多修飾干擾素a2b仍保留71%。體外穩(wěn)定性試驗(yàn)表明在37C人血清放置10h干擾素a2b只保留35%單修飾干擾素a 2b保留71% ,而 多修飾干擾素a 2b仍保留95%的抗病毒活性。結(jié)論聚乙二醇修飾可以增加干擾素a 2b的穩(wěn)定性抗胰蛋白酶水解能力和379人血清穩(wěn)定性。除了抗胰蛋白酶水解能力修飾度的增加能夠明顯增強(qiáng)這種作用。關(guān)鍵詞:干擾素a2b;聚乙二醇修飾干擾素a 2b ;穩(wěn)定性;抗中國(guó)煤化工中圖分類號(hào):Q78文 獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文 章編號(hào):1005-1678MYHCNMHG收稿日期:2001-07-10;修回日期2001-10-20作者簡(jiǎn)介;姚文兵( 1962年出生)男生化藥學(xué)博士主要研究方向?yàn)檑铀_工程藥物的分子修飾天然生物藥物的研制中國(guó)生化藥物雜志Chinese Jourmal of Biochemical Phamaceutics 2001年第22卷第6期93Study on stability of polyethylene glycol-IFN a 2b conjugatesYAO Wen-bing LIN Bi-rong SHEN Zi-long ,WU Wu-tong( School of Bio-pharmaceutics , China Pharmaceutical University , Nanjing 210009 ,China )Abstract Purpose The research was developed to evaluate the stability of polyethylene glycol -IFIN a 2b con-jugates . Methods Anti-viral activity is used as an index to evaluate the thermal stability( at 4C ,25C and37C ) , and the ability of avoiding the trypsin digestion and stability in vitro( at 379C in human serum ) ofmono-PEG-IFN a 2b and poly-PEG-IFN a 2b , then it is compared with IFN a 2b. Results Poly- PEG-IFN a .2b is thermally more stable than mono-PEG-IFN a 2b , and mono- PEG-IFN a 2b more stable than IFN a 2b.The test of anti-trypsin digestion suggests that poly-PEG-IFN a 2b retains 71 % of its anti-viral activity 1 ,mono-PEG-IFN a 2b 50% , IFN a 2b only 7.1 % 30 minutes after being reserved in trypsin solution. Stabilityin vitro indicates that the anti-viral activity of poly-PEG-IFN a 2b is reduced to 95% , mono-PEC-IFN a 2b71% and IFN a 2b 35% 10 hours after being preserved in human serum at 37 C . Conclusion Polyethyleneglycol-IFN a 2b conjugates have improved thermal stability ,ability of protecting from trypsin digestion and sta-bility in vitro . Moreover , the higher the degree of modification , the more stable the IFN a 2b conjugates exceptin the test of anti-trypsin digestion.Key words :IFN a 2b ; Polyethylene glycol -IFIN a 2b conjugates ; Stability ; Anti-viral activity.基因工程藥物的藥物傳遞系統(tǒng)一直 是國(guó)內(nèi)外研單層貼壁生長(zhǎng)2d以上傳代于10%小牛血清RPMI究的熱點(diǎn)其中修飾技術(shù)的發(fā)展相當(dāng)迅速并且不斷1640培養(yǎng)液中生長(zhǎng);冰泡性口腔炎病毒,VSV 病毒,的成熟起來。聚乙二醇修飾技術(shù)運(yùn)用單甲氧基聚乙自行繁殖,- 70C保存。二醇經(jīng)過活化帶上親電基團(tuán),與蛋白質(zhì)分子.上的親人血清南京市血站小牛血清杭州四季青生核基團(tuán)(如自由氨基和末端氨基)共價(jià)結(jié)合，從而改物工程材料研究所;RPMI 1640 美國(guó)Life Technolo-變蛋白質(zhì)的生物化學(xué)性質(zhì)和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)gies公司:胰蛋白酶華美生物工程公司、Serva進(jìn)口道1]聚乙二醇修飾可以改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、水溶分裝。性、生物活性、體內(nèi)半衰期和免疫原性。人重組干擾2方法素a2b是一種多功能細(xì)胞因子具有廣譜抗病毒、2.1 熱穩(wěn)定性抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物活性,臨床上用于治療慢取干擾素a2b單修飾干擾素a 2b和多修飾干性肝炎和毛細(xì)胞性白血病等病毒性疾病和腫瘤。但擾素a 2b溶液，分別于4C、25C和37C放樣定時(shí)是人重組干擾素a2b不具有天然干擾素的糖基化取樣0.3 ml ,- 20°保存。取樣時(shí)間見表1。同時(shí)測(cè)結(jié)構(gòu),生物半衰期短產(chǎn)生中和抗體高,臨床應(yīng)用受定各時(shí)間點(diǎn)的抗病毒活性4]。結(jié)果以活性保留百分到了限制。前文已經(jīng)報(bào)道231活化聚乙二醇的合數(shù)表示。成修飾反應(yīng)條件的優(yōu)化和聚乙二醇修飾干擾素a表1熱穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣時(shí)間2b的分離純化。本文將著重考察干擾素a 2b( IFNa溫度(C)取樣時(shí)間2b),單修飾干擾素a 2l( mono- PEG-IFNa 2b )和多修0.2.4.6、8、10、14、18、24、30 d飾干擾素a 2H( poly- PEG-IFNa 2b )的穩(wěn)定性從中探250.0.5、1、24.6.810 d索聚乙二醇修飾對(duì)干擾素a 2b的作用規(guī)律。370、1、2、4、6. 8、12、24、48、72 h _1材料2.2抗胰蛋 白酶水解能力單修飾干擾素a 2l( 1.05x 10° IU/ml 37.5 puf/中國(guó)煤化工市干擾素a 2b和多修ml純度95%以上)多修飾干擾素a 2l(0.63x 106飾干MYHCNMHG0.1%胰蛋白酶溶液IU/ml ,37.5 pμg/ml 純度95%以上),自制;干擾素a0.8 ml混勻,37C保溫,于0、3、5、10、15、30、60、9021( 90 pg/ml ,4. 6x 108 IU/mg )，天津華立達(dá)生物工min取樣0.1 ml立即與無血清RPMI 1640培養(yǎng)基混程有限公司批號(hào)981202。勻以終止胰蛋白酶的作用。取0.1% 空白胰蛋白人羊膜細(xì)胞周wish細(xì)胞,自行繁殖在培養(yǎng)基中酶溶液0.1ml,用無血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋10294中國(guó)生化藥物雜志Chinese Journal of Biochemical Phamaceutics 2001年第22卷第6期倍，作為空白對(duì)照與各時(shí)間點(diǎn)的供試品同時(shí)測(cè)定抗3.1 熱穩(wěn)定性病毒活性4] ,以校正結(jié)果。結(jié)果以活性保留百分?jǐn)?shù)在4C放置12d干擾素a 2b抗病毒活性只剩表示。9.9% ,單修飾干擾素a 2b的抗病毒活性保留2.3 37°C 人血清穩(wěn)定性33.5%多修飾干擾素a 2b的活性仍保留91%(圖分別取干擾素a2b、單修飾干擾素a2b和多修飾1a)在25C放置4d ,干擾素a 2b的抗病毒活性只干擾素a 2b溶液0.2 ml與處理過的無菌人血清0.8剩14%單修飾干擾素a 2b保留31%的抗病毒活ml混勻37°保溫于0、3.6 12、24.36.72 h取樣0.3性,而多修飾干擾素a 2b的活性仍有71%(圖1b)ml ,- 20C保存。以空白人血清作對(duì)照同時(shí)測(cè)定抗在37°C放置8 h多修飾干擾素a 2b的抗病毒活性病毒活性4]結(jié)果以活性保留百分?jǐn)?shù)表示。保留100%單修飾干擾素a 2b為80%而干擾素a3.結(jié)果2b2 h只剩下20%(圖1c)120R 10010030130 180 Hxoo-D.D5101520253035°24681012u5610152025 30時(shí)間/b& 4Cb 25Cc 37C圖1干擾素a 2b(-◆-)、單修飾干擾素a2b(-■-)、多修飾干擾案a 2b(-▲-)在不同溫度下的穩(wěn)定性因此聚乙二醇修飾能夠在不同程度上增強(qiáng)干1201擾素a2b的穩(wěn)定性修飾程度的增加可以加強(qiáng)這種00作用尤其在4C。3.2抗胰蛋白酶水解能力在相同的測(cè)定條件下胰蛋白酶對(duì)干擾素的活性檢測(cè)并不存在明顯干擾。干擾素a 2b在30 min010203040508070800100時(shí)抗病毒活性迅速降到原來的7.1%,單修飾干擾時(shí)間/min素a2b剩余50%多修飾干擾素a2b仍保留71%。圖3干擾素a_b(-◆-)單修飾于擾素a 2b(-■-)、因此聚乙二醇修飾能夠明顯增強(qiáng)干擾素a2b抵抗多修飾干擾素a 2b(-▲- )在人血清中的穩(wěn)定性(37C)4討論耐胰蛋白酶水解的能力。但是修飾程度的增加對(duì)這人重組干擾素a 2b是由165個(gè)氨基酸組成的單種能力的加強(qiáng)作用并不顯著。見圖2。鏈多肽理論相對(duì)分子量為19237 D,含4個(gè)Cys殘12基形成2個(gè)分子內(nèi)二硫鍵Cys1與Cy98和Cys2910與Cys138其中Cys29 ~ Cys138之間的二硫鍵對(duì)干擾a2b形成特定的立體結(jié)構(gòu)和表現(xiàn)生物活性比較重要。干擾素a2b等電點(diǎn)在5~6之間在pH2.5的溶液中穩(wěn)定在0. 1% SDS中穩(wěn)定對(duì)熱亦穩(wěn)定對(duì)各010203040500708090100種蛋白酶敏感。由人體正常白細(xì)胞分泌的干擾素a.時(shí)間/mnin2b已經(jīng)糖基化,但在大腸桿菌中表達(dá)的干擾素a 2b圖2干擾素 a 2b(-◆-)、單修飾干擾素a 2b(-■-)則未糖基化,且在N末端多一個(gè)甲硫氨酸。人重組多修飾干擾素a 2b(-▲-)的酶解穩(wěn)定性干擾素a2b與天然干擾素a2b的抗病毒活性沒有3.3 37 C人血清穩(wěn)定性明顯中國(guó)煤化工奏a 2b進(jìn)行了聚乙二在相同的測(cè)定條件下血清對(duì)干擾素的活性檢醇修MYHCNMHG特征可能會(huì)發(fā)生某種測(cè)沒有顯著干擾。在379C人血清放置10h,干擾素改變。對(duì)聚乙二醇修飾干擾素a 2b的穩(wěn)定性研究,a 2b只保留35%單修飾干擾素a2b保留71% ,而從一個(gè)側(cè)面將有助于理解聚乙二醇修飾對(duì)干擾素a多修飾干擾素a 2b仍保留95%的抗病毒活性。見2b理化性質(zhì)的影響。圖3。聚乙二醇修飾干擾素a2b的抗胰蛋白酶水解姚文兵等.聚乙二醇修飾干擾素a 2b的穩(wěn)定性研究295能力比干擾素a 2b明顯增強(qiáng),這與文獻(xiàn)[2]報(bào)道一可能具有較長(zhǎng)的生物半衰期。致。這可能是由于SC-PEG只能進(jìn)攻干擾素a 2b分參考文獻(xiàn)子里的親核基團(tuán)(如自由氨基) ,而含有親核基團(tuán)多[1 ] Bailon Ps ,Palleroni AV. Interferon conjugates[ P] . EP 0 809 996，數(shù)為各種堿性氨基酸殘基(如Lys ,His ,Arg ) ,它們均[2]田北立斤號(hào)坯垌笙取7-醇對(duì)干擾素a2b的初步修飾1997-03-12.是胰蛋白酶的作用位點(diǎn)。一旦蛋白分子里引入PEG .中國(guó)煤化工30( 1)74~ 77.分子作為空間屏障能夠阻礙胰蛋白酶的靠近,而[3]林RYHCNMHG醇對(duì)干擾素a2b的分離純.免受水解。化J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2001 ,31( 4)310~ 312.聚乙二醇修飾干擾素a2b的體外穩(wěn)定性試驗(yàn)[4]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中國(guó)生物制品規(guī)程一部[ M]. -九九比干擾素a2b的明顯增強(qiáng)。它與抗胰蛋白酶水解五年版. 北京中國(guó)人口出版社,1995 .268 ~ 269.能力試驗(yàn)的結(jié)暴居同暗示聚乙二醇修飾干擾素a 2b[5]吳梧桐J錫申,劉景晶.基因工程藥物一 基礎(chǔ)與臨閑M].北京人民衛(wèi)生出版社,1996. 160.