中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志2008年2月第11卷第2期文章編號1007-9564(2008)02-0271-04蛋白類藥物聚乙二醇修飾的研究40038重慶市,重慶大學生物工程學院曠瑜王金霞王伯初程永剛·肖中元·徐波關鍵詞蛋白類藥物;聚乙二醇;化學修悼物循環(huán)半衰期的延長。同時,PEG修飾會使蛋白活性降低,這種影響大小與修飾劑、修飾條件和蛋白本隨著蛋白質(zhì)化學和分子生物學的發(fā)展,用于各身的特點相關m種疾病治療的蛋白質(zhì)類藥物的研制和應用已成為生PEG的末端羥基是其反應基團,若直接和蛋物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的熱點蛋白藥物具有作用專一、白反應反應條件較為苛刻會導致蛋白生物活性降高效等優(yōu)點。估計現(xiàn)在蛋白藥物(糖蛋白非糖蛋白0%~35%然而蛋白低或喪失,為使蛋白能在溫和條件下以較高的速率作為藥物注射入生物體內(nèi)時具有自身的缺點:免疫和PEG偶聯(lián),需先將PEG活化如烷基化或?；园胨テ诙堂附庑砸约暗偷娜芙舛?這些缺點等。使之轉化成活潑酯醛基酰肼等嚴重制約了蛋白類藥物的發(fā)展。解決這類問題的方3mPEG修飾蛋白的種類法主要有:①對氨基酸序列的處理以降低免疫原3.1mPEG對氨基的修飾選擇氨基作為修飾位性和酶解性;②連接于免疫球蛋白或漿蛋白如清蛋點,因為氨基具有親核性,且大多存在于蛋白的表白( Albumin);③與藥物載體相結合,以起到對藥物面最普遍的是賴氨酸的c-氨基和N末端氨基的保護和緩釋作用;④連接天然或合成的聚合物。常用的mPEG活性酯有:①PEG二氯三嗪衍生物目前對蛋白藥物進行化學修飾是研究的熱點常用( Peg dichlorotriazine);②PEG三氟乙基磺酸酯修飾劑為聚乙二醇( polyethylene glycol,PEG)及其( PEG tresylate);③PEG琥珀酰亞胺碳酸酯(PEG行生物。succinimidyl carbonate);④PEG苯丙三唑碳酸酯1聚乙二醇(PEG)簡介( PEG benzotriazole carbonate);⑤PEG對硝基苯碳聚乙二醇(PEG)是由環(huán)氧乙烷聚合而成,其分酸酯(PEGp- nitrophenyl carbonate)⑥PEG三氯子式為HO-(cH2CH2O)-CH2CH2-OH,PEG苯碳酸酯( PEG trichlorophenyl carbonate);⑦PEG通常呈電中性,易溶于水和許多有機溶劑如乙醇、二碳酰咪唑酯( PEG carbonylimidazole);⑧PEG琥珀甲苯丙酮等。PEG的分子量從幾百到幾萬,選擇酰亞胺琥珀酸酯( PEG succinimidyl succinate),性大用于醫(yī)藥的PEG分子量主要介于幾百到它們與蛋白的反應如圖120000之間。分子量超過1000的PEG通常無毒,但此類反應具有一定缺陷:①二醇分子的存在;是FDA批準的可用于藥物,食品和化妝品的聚合②僅局限于低分子量的mPEG;③連接鍵不穩(wěn)定④物.直接用PEG修飾時易發(fā)生交聯(lián)和團現(xiàn)象,故副反應較多;⑤選擇性差等。所以修飾結果并不理單甲氧基聚乙二醇( monomethoxy PEG,mPEG)應想。于是有人采用PEG醛來對蛋白進行修飾,例用較多,其分子式為CH3O-(CH2CH2O)CH2CH2-OH,即將PEG一端的活性羥基用甲如 Kinslter等10在對G- CSF, sTNF-RI等進行PEG化時,發(fā)現(xiàn)PEG-丙醛在酸性條件下(pH=5)封閉,以減少或避免交聯(lián)或團聚現(xiàn)象。2PEG修飾蛋白的原理與a-氨基的偶合具有高的選擇性,這是由于a-氨PEG與蛋白的非必需基團結合后可作為一種基和其他親核類基團相比具有較低的pKa值.親屏障擋住蛋白分子表面的抗原決定簇,避免抗體的電類PEG符生物與氨基酸殘基反應時很大程度上產(chǎn)生或者阻止抗原和抗體的結合而抑制免疫反應的取決于氨基酸殘基的親核性親核反應只有在蛋白產(chǎn)生。蛋白經(jīng)PEG修飾后,分子量增加,腎小球過水溶液的pH值高于或接近于殘基的pKa值時才濾減少,PEG的屏障作用保護了蛋白不易被蛋白酶會發(fā)生口。另采用PEG醛的衍生物以及PEG羧酸降解同時減少了抗體的產(chǎn)生,這些均有助于蛋白藥酯也可在蛋白修飾時具有較高的專一性口·太攝集團四南藥業(yè)殷份有限公司·272Chinese Journal of Coal Industry Medicine Feb 2008, vol 11, No. 23.2PEG對巰基的修飾蛋白中的巰基主要為半( hydrazone)或與PEG-胺(PEG-amne)反應生胱氨酸殘基所攜帶,由于蛋白表面半胱氨酸殘基數(shù)成可逆的Sch堿( Schiff base)1用硼氫甲腈鈉比賴氨酸殘基數(shù)少得多,所以蛋白中半胱氨酸殘基可將腙還原為更穩(wěn)定的烷基肼化物,而Scif堿可被是一個很好的靶位可以實現(xiàn)對蛋白的特異性修飾。還原為仲胺。用PEG氨基進行還原性烷基化存在常用的PEG修飾劑及反應如圖2。的主要問題是蛋白質(zhì)上的氨基與PEG氨基具有相似的反應活性,就有可能形成交聯(lián)聚集體。此情況下PEG肼化物就更為實用。PEG對蛋白羧基的修飾羧基的修飾位點包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。通常在二環(huán)已基碳二亞胺(DCCI或1-乙基-3-二甲氨基丙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)存在下羧基可與氨基PEG結合,但同時也易產(chǎn)生其他的交聯(lián)反應1。近年來發(fā)現(xiàn)PEG-酰肼(PEG- hydrazide)可與羧基特異結合。在EDC存在下,酸性條件(pH4.5~5.0)時,蛋白質(zhì)中氨基被質(zhì)子化而無交聯(lián)反應的發(fā)生。反應如圖3圖1與氨基反應的PEG衍生物圖3PEG-酰肼對羧基的修飾3.5PEG對蛋白的可逆修飾大多數(shù)PEG化化學的設計是使PEG與蛋白質(zhì)之間形成穩(wěn)定的連接-m一-“,鍵以利手屬聯(lián)物的覽化和長期保存,但有時PEG會占據(jù)或屏蔽蛋白質(zhì)的活性位點而降低其活性。另外,PEG偶聯(lián)物分子量對于蛋白的活性有直接影響,分子量越大,則體外活性越低而體內(nèi)活性越2) mPBG-CH-CH+sHR一mPB0cHC高。最優(yōu)蛋白PEG修飾目標是既要延長藥物的半衰期,又不降低藥物的活性。mmdm,→ go-NHdw種方法是在蛋白和PEG之間采用可降解的化學鍵連接,然后在另外的條件或酶的作用下使蛋白從連接物上釋放出來,從而恢復蛋白活性。例+SH-R如(見圖4)。圖2和驤基反應的PEG衍生物及其反應若蛋白中已有的巰基不理想,可采用基因工程手段將半胱氨酸引人到蛋白的特定位點,就可以采用對巰基有特異性反應的PEG衍生物對巰基進行R-NH高選擇性修飾。但通過這種途徑引入半胱氨酸,會增加不正確二硫化物和蛋白二聚的幾率aPBC-0-CHALCHCL OCHCHICHL-NH-R3.3PEG對糖類殘基的修飾對糖類殘基的修飾也是一種定點PEG化的方法[1,糖類經(jīng)過酶或化學氧化劑氧化,產(chǎn)生具有反應活性的醛基,這些醛基mPEGOCHaL0HCOH+ HOCR(CHa)H№可以和PEG-肼(PEG- hydrazide)反應生成腙圖4蚤白和PEG雙酯的結合與釋放過程中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志2008年2月第11卷第2期273·影響PEG修飾反應的因素聯(lián)分子數(shù)增加后,修飾不均一性也會增加。蛋白經(jīng)過PEG修飾后,性質(zhì)會有多方面的改4.7藥物濃度藥物濃度的增加增大了藥物分子變6-1:①免疫原性和抗原性的降低;②循環(huán)半衰和聚乙二醇分子碰撞的機會能提高反應速率;但濃期的延長;③溶解性增加;④耐蛋白酶水解;⑤生物度增大的同時也增加了藥物形成多聚體的機會,產(chǎn)利用度提高;⑥毒性減小;⑦熱穩(wěn)定性和機械穩(wěn)定性物的均一性會減小。所以必須兼顧二者的平衡。增加;⑧等電點電泳行為以及動力學性質(zhì)的改變。4.8反應時間隨著時間的增加,產(chǎn)物的修飾率會同時,蛋白經(jīng)修飾后,其生物活性會降低。影響因素增加,但產(chǎn)物的不均一性也會增加。有多種,主要取決于PEG化程度、PEG化位點及修以上因素對PEG修飾的影響對于不同的蛋白飾蛋白構象和電荷的影響等。所以有必要建立有所不同要根據(jù)蛋白本身特點,同時考慮修飾后的PEG修飾最優(yōu)方案,以實現(xiàn)蛋白藥物生物活性的保目的,修飾的程度、修飾位點的選擇、產(chǎn)業(yè)化難易程留、一般性能的改善產(chǎn)品毒性減少,反應后產(chǎn)品的度及生產(chǎn)成本等因素,通過單因子及正交實驗確定高回收率等。最優(yōu)方案篩選應考慮如下因素最優(yōu)反應工藝4.1修飾劑的選擇修飾劑的選擇應綜合考慮修5結語飾劑的水解穩(wěn)定性及反應活性、修飾劑與蛋白質(zhì)M.J. Roberts等10提出PEG修飾的分代學,基酸殘基之間反應專一性、修飾位點、修飾劑與蛋白第一代PEG技術主要限定于小分子量PEG,因為質(zhì)連接鍵的穩(wěn)定性、毒性、抗原性、修飾后是否需要在高分子量mPEG中含有大量二醇(聚合過程中水進一步分離是否適于建立快速方便的分析方法、修的存在所引起)。高二醇含量會引起很多的問題如飾劑是否能夠簡便快速地合成或購買等因素2],交聯(lián)現(xiàn)象。另外,第一代PEG技術中低分子量4.2修飾反應的pH值pH值是PEG修飾蛋白PEG修飾沒有選擇性,也是由于小分子量PEG有的一個重要的因素因為它決定了具有潛在反應能更多的機會刺穿蛋白分子的表面,從而引起較多位力的功能基所處的可反應和不可反應的離子狀態(tài),點的結合。而第二代的PEG化技術避免了第一代般情況下,增加pH可以提高反應速率,降低技術的缺點,多采用高分子量PEG活性酯,同時改值會減小反應速率。同時控制合適的pH值可以對進了生產(chǎn)工藝,降低了PEG中二醇的含量,其應用蛋白中氨基酸殘基進行特異性修飾,使修飾專一性越來越廣泛[,1提高,從而提高收得率降低分離難度減少生產(chǎn)成經(jīng)過PEG修飾的藥物蛋白不僅較高地維持了本原藥的生物活性,而且能夠有效地降低或消除其免4.3藥物與PEG的摩爾比通常情況下,隨著疫原性和毒性。同時,由于分子量和交聯(lián)度的增加,PEG和蛋白的摩爾比增加修飾蛋白的相對分子質(zhì)修飾后的藥物蛋白的循環(huán)半衰期顯著延長。從而顯量也會增加蛋白的修飾率會提高但修飾的不均一示了藥物蛋白PEG修飾技術的良好應用前景。度也會增加生物活性保留會下降故必須控制合適6參考文獻的比例,使蛋白修飾率最高,同時也盡可能保留蛋白[1]姜忠義,許松偉,王艷強蛋白質(zhì)和肽類分子的聚乙的生物活性。二醇化化學[J]有機化學,2003,23(12):13404.4反應溫度蛋白藥物對溫度的穩(wěn)定性較差,要1347使蛋白藥物修飾后仍然保留高的生物活性,反應必[2]K. Rajender Reddy MD, Marlene W. Modi PhD,s須在蛋白的耐受溫度下進行。而同時溫度也決定反應速率,影響修飾的均一性。對于巰基的修飾來說KD)(Pegasys) for the treatment of hepatitis C[].溫度可以影響到活性巰基的微環(huán)境,仔細選擇溫度Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54: 571可以降低活性,防止一些競爭基團的反應4.5PEG分子量增加PEG的分子量可以延長[3] Yu- Sen Wang, Stephen Youngster, Micheal Grace藥物的半衰期。而且支鏈的PEG比直鏈的更具有gylated recombinant interferon alpha- 2b and its優(yōu)勢,因為支鏈的PEG可以減緩在腎小球中的濾therapeutic implications[J]. Advanced Drug DeliveryReviews,200254:547-5704.6偶聯(lián)的PEG分子數(shù)增加偶聯(lián)的分子數(shù)等于[4] Veronese FM, Morpurgo M. Bioconjugation in phar增加PEG的分子量,因而也會延長半衰期。但是偶maceutical chemistry[J]. Inter J Pharmaco, 1999, 54,274·Chinese Journal of Coal Industry Medicine Feb 2008, VoL 11, No. 2istry and Biological applications[A]. Acs symposi[5] Zalipsky S Chemistry of poly (ethylene glycoDcon-um Series No680[C]. Washington, DC, Amerricanugates with biologically active molecules [J]. AdvChemicalDrug deliv Rev, 1995. 16:157[14] M. J. Roberts, M. D. Bentley, J M. Harris, et al.[6] Rameshraja P, Huashan W. Anil G. Current aspectsChemistry for peptide and protein PEGylation[J].in pharmacology of modified hemoglobins [J].AdvAdvanced Drug Delivery Reviews, 2002, 541459Drug Deliv Review, 2000, 40,185[7印春華,張敏蛋白質(zhì)和多肽類藥物的PEG結合[15] Anthony Meager, Rose Gaines Das, Kathryn2oon,et物一一種新型給藥系統(tǒng)[門].中國藥學雜志2001,36Health Organization International Biological Stand-[8]姜忠義許松偉高蓉.生物分于化學修飾用聚乙二ards for human interferon alpha and omega[J]. Jour-醇衍生物的合成及應用[]高分子通報,2002,14nal of Immunological Methods, 2001. 257-17-33(1):34-40[16] Alexander Deiters Site-specific PEGylation of pro-[9] Andrew P. Chapman. PEGylated antibodies and antiteins containing unnatural amino acids]. bioorganicbody fragments for improved therapy a review[J].Medicinal Chemistry Letters,2004,14,5743Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 5315745[17] Kdera Matsuchima A, Hiroto M, et al. Pegyla[10] Kinstler O. B Brems D N, Lauren S L, et al.Char-acterization and stability of N-terminally Pegylat-and technical applications [J]. Prog Polymer Scied rhG-CSFU] PharmRes, 1996. 13,9961998,23:1233-1271[11]姜忠義高蓉許松偉等蛋白質(zhì)的化學修飾研究進[18] Roberts MI, Bentley M. D, Harris J M. Chemistry of展[現(xiàn)代化工,200121(8)25-28peptide and protein PEG ylation[J]. Advanced Drug[12]吳潔,劉錄晶,胡卓逸.蛋白質(zhì)藥物的聚乙二醇修飾Delivery Reviews, 2002, 541459J].藥學進展,2002,26(3)146-151[2006-12-14收稿2007~-04-10修回][13] Harris JM, Zalipsky S, Poly(ethylene glycol) Chem-文章編號1007-9564(2008)02-0274-02完全腹腔鏡下右肝癌切除2例363000福建省津州市,福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院普外一科李建國韓明瑞陳德烽李輝林志川關鍵調(diào)肝癌;腹腔鏡;外科手術塊,AFP>1000ng/L,乙肝小三陽,肝功能 childA級。胃鏡提示:十二指腸球部潰瘍(S1期)。資料與方法1.2手術器械腹腔鏡(美國史賽克)超聲止血刀11病例資料例1,男,57歲,主訴右上腹悶痛(美國強生公司制造)腹腔鏡彭氏多功能刮吸器2個月于2006年3月15日入院。彩超提示:右肝1.3手術方法全麻下腹腔壓力14mmHg臍下前葉4.3cm×3.9cm×3.7cm腫塊;MR:左肝內(nèi)葉建立觀察孔,置入10mm30度鏡,劍突下建立主操4.3cm×4.4cm×4.5cm,AFP>10009/L,乙肝作孔,右助下及右腋前線平臍建立輔助孔。無肝門小三陽,肝功能 child a級。胃鏡提示:慢性淺表性阻斷,采用超聲刀及彭氏多功能刮吸器交替使用切胃炎。肝法,遇血管、膽管用鈦夾夾閉。肝殘面止血后用生例2,男,54歲,主訴右上腹疼痛于2006年6月物蛋白膠覆蓋標本置人標本袋后經(jīng)右肋下操作孔29日人院,彩超提示:右肝30cm×32cm×3.0擴大后取出,常規(guī)置雙套管沖洗引流。cm腫塊,CT:左肝內(nèi)葉3.0cm×2.6cm×3.0cm腫2結果