Chinee Journal of New Druge 2007, Vol. 16 No. 13中國新藥雜志2007年第16卷第13期聚乙二醇接枝殼聚糖聚離子膠束的制備與體外表征研究楊可偉,李馨儒,楊卓理,劉艷(北京大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)系，北京100083)[摘妻] 目的:制備載有甘草酸二銨(DG)的聚乙二醇接枝殼聚糖(mPEG-CS)聚離子膠束,考察膠束的理化性質(zhì)及體外釋放機制。方法:通過殼聚糖烷基化合成mPEG-CS,以三聚磷酸鈉為引發(fā)劑,利用靜電相互作用制備載有DC的mPEG-CS聚離子膠束?？疾炷z束的形態(tài)、粒徑和zeta電位。用透析袋法研究載藥膠束在不同介質(zhì)中的釋放動力學(xué)。結(jié)果:制得膠束的平均粒徑為(38.2+0.9)nm;包封率為(97.6+0.7)%;膠柬的穩(wěn)定性良好;膠束的釋放與釋放介質(zhì)的種類、pH值和濃度有關(guān)。結(jié)論:mPEC-CS是一種良好的制備聚離子膠束的高分子材料,聚離子膠東是離子型藥物的良好載體。[關(guān)鍵詞] 聚離子膠柬;殼聚糖;甘草酸二銨;體外釋放[中圖分類號] R943. 42;R975. 5[文獻標(biāo)識碼] A[文章編號] 1003 - 3734(2007)13- 1030 -05Diammonium glycyrrhizinate loaded methoxy PEG-grafted-chitosanpolyion complex micelles: preparation and in vitro characterizationYANG Ke-wei ,LI Xin-ru, YANG Zhuo-li,LIU Yan( Department of Pharmaceutics ,School of Pharmaceuical Sciences ,Peking University ,Bejing 100083 ,China)[Abstract] Objectives: To prepare and characterize the diammonium glyeyrhizinate loaded me-thoxy poly( ethylene glycol ) -grafted-chitosan polyion complex micelles ( mPEG-chitosan PIC micelles).Methods: mPEG-chitosan was synthesized by alkylation of chitosan with mPEG-aldehyde. mPEG -chi-tosan PIC micelles were prepared using sodium tripolyphosphate as an initiator via the electrostatic inter-action. The micelles were observed under the transmission electron microscopy (TEM). Mean size andzeta potential values of the micelles were measured using a zetasizer based on the dynamic light scatter-ing. In vitro release of the diammonium glyrrhizinate-loaded mPEG-chitosan PIC micelles was measuredusing a dialysis method in various buffered solutions. Results : Diammonium glyeyrrhizinate-loadedmPEC-chitosan PIC micelles were successfully prepared with an average diameter of (38.2 +0. 9) nm.Encapsulation eficiency of diammonium glyeyrrhizinate was(97.6 +0.7)%. The micelles were stable atroom temperature for 1 month , and the release rate was dependent on the anionie patterns, pH values and[作者簡介]呂慶淮(1962-),男,副教授,主要從事精細化[4] KOICHI Y, KIYOSHI T. Proces for producing opicallyl necive學(xué)品的合成工作。聯(lián)系電話:(0539) 2060183 - 800, E-mail:benzene- sulonanide derivatives:EP , 0380144 [P]. 1990 -08 -01.becyis@ 163. com。[5] OFOSU-ASANTE K, STOCK LM. 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Conclusion : mPEG-chitosan PIC micelles could be used as a poly-mer carrier suitable for encapsulation of anionic drugs.[Key words] polyion complex micelles ;chitosan ;diammonium glyrhizinate; in viro release近20年來,具有核殼結(jié)構(gòu)的大分子膠束由于材料與方法具有高效、長效、安全等特點受到廣泛關(guān)注,已經(jīng)成為藥劑學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點"。最初,大分子膠1試藥與儀器束主要由兩親性嵌段共聚物形成,聚合物的疏水嵌傅立葉變換紅外光譜儀AVATAR360(美國段在水中通過疏水相互作用構(gòu)成膠束的內(nèi)核,而親.NICOLET) ;納米粒度儀( Malvem Zelasizer , nano se-水嵌段則在膠束內(nèi)核的周圍構(gòu)成膠束的外殼,用于ries. ,ZEN3500 ,UK) ;Hitachi . - 500 型透射電子顯微鏡增溶疏水性藥物。除了疏水相互作用外,聚離子聚(日本HITACHI公司) ;6010型紫外可見分光光度計合物與帶相反電荷的物質(zhì)之間的靜電相互作用也可(惠普上海分析儀器廠);臺式離心機TGL- 16C(上作為形成膠束疏水內(nèi)核的驅(qū)動力,由此形成一種新海安亭科學(xué)儀器廠); MSL2300型核磁共振儀(德國型膠束-聚離子復(fù)合物膠束( polyion complex mielle,Bruker) ;LC- 10AT高效液相色譜儀(SPD - 10A紫PIC micelle)。利用PIC膠束,已經(jīng)成功包載蛋白質(zhì)外檢測器,日本SHIMADZU公司),透析袋(膜截留相類[2]核酸類[3-7]等藥物。PIC 膠束具備傳統(tǒng)聚合對分子質(zhì)量3500 ,美國spectrum)。物膠束的特點:結(jié)構(gòu)穩(wěn)定;粒徑小且粒徑分布窄;體DG(99%，北京天衡藥物研究所,批號:內(nèi)循環(huán)時間長;安全性好;具有靶向性(6.8-10);制備20050520) ;聚乙二醇單甲醚( methoxy poly ( ethylene簡單,易于貯存等。此外,PIC膠束還具有其獨特優(yōu)glycol) ,mPEG , Mn =2000, Fluka);CS(相對分子質(zhì)勢:載藥范圍廣泛;載藥過程基本在水溶液中進行,量10000,青島思特科技有限公司);三甲基苯磺酸.避免有機溶劑的使用,可以消除溶劑殘留引發(fā)的毒(Tr-nitro benzene sulfonate ,TNBS ,Sigma) ;氰基硼氬化鈉( NaBH,CN , Sigma) ;TPP(徐州天富化工有限公副作用等。殼聚糖( chitosan ,CS)是甲殼索脫乙?；漠a(chǎn)物，司) ;其他試劑均為分析純?；瘜W(xué)名為(1,4)-2-氨基-2-脫氧-B_D-葡聚糖,是自然2 mPEG-CS的合成與表征界中惟一的堿性多糖,是一種具有生物相容性、生物2.1mPEG的醛基化")將mPEG溶于無水可降解性及pH敏感性的陽離子聚合物。在弱酸性DMSO中,加人適量的乙酸酐,室溫下攪拌8h。然介質(zhì)中,殼聚糖分子中的氨基質(zhì)子化,使殼聚糖帶正后用乙醚沉析、過濾、真空干燥。再用氯仿溶解，電,它可以與某些荷負電的物質(zhì)通過靜電相互作用發(fā)乙醚沉析,過濾后真空干燥,重復(fù)3次。得到醛基化的mPEG(mPEG-CH0)。產(chǎn)物用紅外光譜進行生聚集,故可以作為PIC膠束的聚陽離子鏈段。檢測。聚乙二醇( poly( ethylene glycol), PEG)是形成2.2 mPEG-CS 的合成"與表征將CS溶于pH膠束應(yīng)用最為廣泛的親水嵌段。極強的水化作用及4.9的醋酸鹽緩沖液中，按mPEG-CHO與CS單體高度的構(gòu)象柔韌性使PEG在膠束外側(cè)形成一層致的物質(zhì)的量比1:10加入mPEG-CH0,室溫下振蕩密的水化“殼" ,使膠束具有空間穩(wěn)定性。同時PEC24h后,加入NaBH,CN,再于室溫下振蕩48h。然鏈的柔順性使其長鏈來回擺動,分子構(gòu)象來回變動,后將反應(yīng)液移人透析袋內(nèi),用蒸餾水透析72 h,透析模糊了免疫系統(tǒng)的識別和吞噬,使膠束具有了隱形液過濾后冷凍干燥。凍干粉用丙酮抽提除去未反應(yīng)的能力。親水嵌段的這些性質(zhì)可延長膠束在體內(nèi)的的mPEG-CHO,即得到mPEG-CS。聚合產(chǎn)物用'H-循環(huán)時間,避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬,并且末端具有NMR進行檢測。采用TNBS法["3)測定mPEC-CS的功能基團的PEG為膠束的靶向性提供了可能[6.9]。接枝率。本實驗合成了PEG接枝殼聚糖( mPEG-CS),以2.3 mPEG-CS 的pH敏感度測定將mPEC-CS甘草酸二銨( diammonium glyrrhizinate, DG)為模分散中國煤化工乙酸溶液,用pH型藥物,用三聚磷酸鈉(TPP)作聚集引發(fā)劑,制備載計監(jiān)0HCNMHGnm處監(jiān)測該過程有DG的PIC膠束,并考察了其物理化學(xué)性質(zhì)和體中吸收皮的變化，傭正mrro-us在水中溶解的pH外釋放的機制。值范圍。.一1031一Chinese Jourmal of New Druge 2007 ,Vol.16 No. 13中國新藥雜志2007年第16卷第13期3PIC膠束的制備及包封率的測定0H末端羥基氧化為醛基。將mPEG-CS溶于pH 3.5的醋酸鹽緩沖液中，用氫譜驗證了聚合物mPEG-CS的結(jié)構(gòu)。結(jié)果如與DG溶液混合后,在攪拌下向其中滴人適量的下, HNMR(D20,含10% DCI,300 MHz):8 5.12 ~TPP溶液,即得PIC膠束。5.38(H-1,H-1'),3.81(H-3, H4, H-6') ,3.67(H5,將制備的PIC膠束溶液用截留相對分子質(zhì)量為H6),3. 52(-0CH2),3.25(-0CH,),3.09(H-2),3000的超濾管進行超濾,用HPLC法測定濾液中DG2.09(NHAc),與文獻[14,15]相符,證明已將mPEG的濃度。色譜條件:DiamondODSCrg色譜柱(150接枝到CS.上。按TNBS法測定的接枝率為9.89%。mmx4.6 mm,5 μm) ,流動相:甲醇-5%冰醋酸水溶CS為堿性多糖,一般在低pH值下易溶,在高液(82:18),檢測波長:252nm,流速:1.0mL.min-1pH值下難溶。為了評價mPEG-CS的溶解性與pH柱溫:30 C。按照如下公式計算包封率:包封值的關(guān)系,在 420 nm波長處對不同pH值下溶液的率/%=(投藥量-濾液中DG濃度x超濾前膠束溶透光率進行了考察。將mPEG-CS直接分散在蒸餾液體積)/投藥量x 100。水中,得混濁液體,隨著乙酸溶液的加入,體系的pH4膠束的形態(tài)及粒徑考察.值逐漸下降,體系慢慢變澄清,透光率值也逐漸增用動態(tài)光散射( Dynamic light scattering, DLS)法大。當(dāng)pH<5.58時溶液完全澄清,透光率值趨于測定膠柬的粒徑及粒徑分布(Plydispersityindex，穩(wěn)定。因此mPEG-CS在pH<5.58的水溶液中可PDI) ,用納米粒度儀測膠束zeta電位。以磷鉬酸負以完全溶解,在pH >5.58的水溶液中部分溶解,所染法制備膠束樣品,于透射電鏡( Transmission elec-以在制備膠束時應(yīng)注意控制溶液的pH值。tron microscopy ,TEM)下觀察膠束的形態(tài)。2PIC膠束的形態(tài)與粒徑5藥物在膠束中的位置考察.圖1為膠束的透射電鏡照片。圖1A清晰地顯將膠束溶液超濾后,冷凍干燥,用KBr壓片法示出膠東呈球形,粒子大小均勻,計算得到的平均粒進行紅外光譜的測定,并同時記錄DG的紅外光譜,徑為(21.6 +4.8)nm(n= 100)。由圖2B清晰可考察藥物在膠束中的位置。見,在膠束的內(nèi)核外有一冠狀層,該圖清晰地顯示出6膠束的初步穩(wěn)定性考察膠束的核殼型結(jié)構(gòu)。將新鮮制備的膠束溶液密封于西林瓶中,置于60 C的恒溫箱中,于0,2 ,4,7,14d分別取樣測量粒徑。同時將新鮮制備的膠束溶液超濾,除去游離的藥物后,密封于西林瓶中,于室溫下放置1個月,測量粒徑變化,同時超濾膠束溶液,用HPLC法測定濾液中藥物的含量,考察膠束中藥物的泄露情況。A放大5x10*倍B放大1x10*倍7體外釋放試驗圖1 甘草酸二銨的PIC膠束的透射電鏡圖取1 mL膠束溶液裝入透析袋內(nèi),置于30 mL,DLS法測得膠束的粒徑為(38.2 +0.9) nm。比37 C的釋放介質(zhì)中,攪拌,分別于0.25 ,0.5,0.75，TEM 法測得的粒徑要大,原因是DLS方法中膠束粒1,1.5,2,3,4,6,8,12,20h定時取出釋放介質(zhì)3.0子處于“濕"狀態(tài),膠束表面的PEC鏈溶劑化,呈舒mL,同時補充相同體積的新鮮釋放介質(zhì)。用HPLC展?fàn)顟B(tài),膠束的粒徑相對較大;而進行TEM測定時,法測定釋放介質(zhì)中的藥物含量,繪制釋放曲線。并膠束粒子處于“干燥”狀態(tài),膠束表面的PEG鏈呈卷分別考察膠束在不同釋放介質(zhì)、不同pH值的緩沖縮狀,故膠束的粒徑相對較小。液和不同濃度的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的釋放動力3藥物在膠束中的位置學(xué),以探究PIC膠束的藥物釋放規(guī)律。圖2為膠束凍干粉和DG的紅外光譜圖。形成膠束后,DG在1717cm:'處的羰基峰消失,而出結(jié)果與討論現(xiàn)1577 cm~'的大峰,表明DG的羰基與CS的氨基1 mPEG-CS的表征發(fā)生熱中你用北亦了甘光學(xué)性質(zhì),這與文獻mPEG-CHO的傅立葉變換紅外光譜與mPEG- [16中國煤化工包封在膠東內(nèi)核。0H的譜圖相比,在1 738 cm~'處出現(xiàn)醛基特征峰，采CN M H G為(97.6+0.7)%其他峰位置與mPEC-0H一致,證明已經(jīng)將mPEG- (n=4)。-一 1032一Chinee Jourmal of New Drugs 2007,Vol. 16 No. 13中國新藥雜志200年第16卷第13期根據(jù)膠束在不同釋放介質(zhì)中的釋放行為,可以1717,推測DG-PIC膠束的釋放機制可能為由離子交換誘s 1600se導(dǎo)的溶脹和擴散。由于膠束的內(nèi)核帶正電,在核殼的界面區(qū)域可吸附一定量的甘草酸負離子。在釋放15773500 3000 2500 2000 1500 1000 500初期,首先是吸附在界面區(qū)域的藥物與釋放介質(zhì)中的陰離子發(fā)生交換,產(chǎn)生突釋現(xiàn)象。隨后膠束內(nèi)核圖2 DG原料(A)和DC-PIC膠束(B)的紅外光譜圖中的甘草酸負離子和三聚磷酸根負離子與溶液中的4膠束的初步穩(wěn)定性圖3為60C放置過程中膠束的粒徑和多分散陰離子逐漸發(fā)生交換，導(dǎo)致膠東內(nèi)核的離子相互作性的變化情況。結(jié)果表明,在60下7d之內(nèi),膠用減弱,釋放介質(zhì)慢慢滲透進人內(nèi)核,使膠束溶脹，束的粒徑和多分散性指數(shù)(PDI)只有微小變化,說又進一步加速內(nèi)核的離子交換,如此相互作用,最終明膠束的結(jié)構(gòu)至少可以在7 d內(nèi)保持穩(wěn)定。14d 時使藥物完全釋放出來。對于膠束在純水中的釋放，粒子的粒徑明顯增大,PDI也相應(yīng)增大,說明膠束間由于沒有可供交換的離子,所以僅有核殼界面區(qū)域發(fā)生了聚集。而在室溫下,即使放置1個月,膠束的吸附的部分藥物緩慢釋放到水中。另外,與等濃度的粒徑只發(fā)生微小變化(由38 nm變?yōu)?1 nm)。由此氯離子相比，磷酸根離子所帶電荷更多,離子交換能可見,此類膠束對熱不穩(wěn)定,應(yīng)避免在高溫下貯存。力更強,所以在PBS中藥物的釋放更快。膠束zreta電位隨藥物釋放的變化進一步 證明DC-PIC膠東藥物的釋放主要由離子交換控制。■粒輕9+ PDI5.2 釋放介質(zhì)的pH值對釋放行為的影響 圖5為載藥PIC膠束在等濃度(50 mmol.L")不同pH值的釋放介質(zhì)中的釋放曲線。經(jīng)過20 h,膠東在pH4.0的PBS中釋放63%,在pH 7.4的PBS中釋放圖360心時膠束溶液的粒徑和PDI隨時間的變化曲線91% ,在pH9.0的PBS中釋放97%。隨著釋放介膠束室溫放置1個月后,僅有0.05%的藥物泄質(zhì)pH值的升高,藥物釋放加快。這可能與CS的結(jié)漏,表明藥物在室溫條件下可以穩(wěn)定存在于膠束內(nèi)構(gòu)特點有關(guān)。CS 的pKa為6.5,其荷電情況與溶液核中。載藥膠束的長期穩(wěn)定性正在進- -步的實驗研的pH值有關(guān)。Shu等”計算出不同pH值時CS的究中。帶電狀態(tài)。在酸性溶液中CS帶正電荷較多，隨著5體外釋放pH值升高,氨基逐漸脫質(zhì)子化,單位鏈長的CS所5.1 釋放介質(zhì)種類對釋放行為的影響 圖4為載帶正電荷數(shù)減少。同樣在本研究中,釋放介質(zhì)的pH藥膠束在不同釋放介質(zhì)中的釋放曲線。由圖4可知，值越高,PEG接枝的CS脫質(zhì)子化的程度也越大,使在蒸餾水中藥物釋放極其緩慢,20 h僅釋放6. 7% ;在CS鏈上的正電荷數(shù)減少,與甘草酸負離子和三聚磷生理氯化鈉溶液中,20 h藥物釋放72. 2%;在與生理酸根負離子的相互作用減弱,導(dǎo)致藥物釋放加速。氯化鈉溶液同濃度(154 mmol.L-")的pH 7.4的?PBs(H9.0)30 to PBS(pH7.4)PBS中藥物釋放最快,20h釋放93. 5%。粒徑測量、凸 PBS(H4.0)需酸鹽圾沖液(PH4.)結(jié)果顯示,膠束在純水中釋放前后的粒徑和zeta電位均只發(fā)生微小變化。而在PBS中釋放20h后膠束粒徑由最初的45nm增大到300nm,zeta電位由最初的40mV下降到0。1416182022圖S膠東在不同 pH的釋放介質(zhì)(50 mmolL1)t女DG綹纏在PBS中的釋放作對照中釋放曲線(n=3)去PH 7.,4的154 mmolrL'PBS生理氯化的落誡此外,從圖5中還可以看出,即使同是pH4.0也盛飾水的釋中國煤化工中液中的釋放比在PBCN M H G的藥物釋放受釋放101214181820介質(zhì)中陰離于性質(zhì)的影響。圖4不同釋放介質(zhì)中膠束的釋放曲線(n=3)5.3釋放介質(zhì)濃度對釋放行為的影響圖6 為Chinese Journal of New Drygs 2007 .Vol.16 No. 13中國新藥雜志2007年第16卷第13期DG-PIC膠束在不同濃度的PBS中的釋放曲線。緩.4] 魏曉紅,梁文權(quán),潘遠江. PEC化殼秦糖/DNA自組裝復(fù)合沖液濃度越低,藥物釋放越慢。這是由于釋放介質(zhì).物的制備、表征和體外Hela細胞轉(zhuǎn)染研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報, 2003, 24(11) :1993 - 1996.的濃度降低,導(dǎo)致釋放介質(zhì)中的陰離子與甘草酸負[5] HARADA A. TOGAWA H, KATAOKA K. Physicochemical離子和三聚磷酸根負離子的交換變慢,于是藥物釋propertics and nuclease reistance of antisenseoligodeoxynucleoti-放速度減慢。des entrapped in the core of polyion complex micelleas composedof poly( ethylene gyeol) .poly( L.lygine ) bloeok copolymers[J].Eur J Pharm Sei2001, 13(1) :35 -42.心154 mol/L'PBS合50 mmol-L'PBS6] WAKEBAYASHI D, NISHIYAMA N, YAMASAKI Y, et al.女5 mmo'rL'PBSLactose-conjugated polyion complex micelles incorporating pla8-mid DNA as a targeable gene vector system: their preparationand gene transfecting eficiency against eultured HepC2 celle0246810121416182022[].J Control Release, 2004, 95(3) :653 -664.圖6膠東在不同濃度PBS( pH =7.4)中的釋放曲線(n=3)7] TIAN HY, DENG C, LIN H, et al. Biodegradable cationie PEG-PEI-PBLG hyerbranched bloek copolymer; synthesis and micelle結(jié)論characteization[J]. 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